实验笔记丨CAR-T细胞毒性实验步骤详解

科研日精进 科研日精进课堂 2022-04-27 17:41

在通过实验得到改造好的CAR T细胞后，需通过CAR T 细胞毒性实验进行检测。本研究通过流式检测CAR T细胞裂解肿瘤细胞的能力。通过标记肿瘤细胞，用细胞凋亡检测试剂 Annexin V 和 PI 检测肿瘤细胞的凋亡，判断 CAR T 细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

肿瘤细胞株 NKG2D 配体表达水平的检测

将Panc-1、Panc-28、Capan-2、SW1990四种胰腺癌细胞用胰酶消化后，加入等量的DMEM完全培养基终止消化反应，吹打为细胞悬液。1200 rpm离心3 min，去上清。加入3 mL PBS重悬细胞后，取少量细胞悬液4℃，1200 rpm离心3 min，将上清吸去。每个样品中加入100 μL FACS洗液和0.3 μL MICA/B（NKG2D的配体）的抗体后，重悬细胞，4℃避光孵育30 min，加入1 mL FACS洗液，重悬细胞，4℃，1200 rpm离心3 min，弃上清，重复洗涤两次，洗去多余的或非特异性结合的抗体，进行流式检测。

CFSE 标记靶细胞

取生长较好的 Panc-1、Panc-28、SW1990 肿瘤细胞，胰酶消化后，加入等量的 DMEM 完全培养基终止消化反应，吹打为细胞悬液，1200 rpm 离心 3 min，弃上清。加入 3 mL PBS 洗涤细胞，1200 rpm 离心 3 min，弃上清，重复洗涤两次。加入 1mL PBS 和 1 μL CFSE（5 μM）染料，重悬细胞后，37℃避光染色 15 min。加入 3 mL 预冷的 DMEM 完全培养基，4℃避光静置 10 min，4℃，1200rpm 离心 3 min，弃上清。加入 3 mL PBS 重悬细胞后，1200 rpm 离心 3 min，弃上清，重复洗涤两次。加入 1 mL X-VIVO 基础培养基重悬细胞，即为 CFSE 标记的肿瘤细胞悬液。

肿瘤细胞与 CAR T 细胞共孵育

① 1200 rpm 离心 3 min 收集 CAR T细胞，弃上清，加入 1mL X-VIVO 基础培养基重悬细胞后，对细胞和CFSE 标记的肿瘤细胞进行计数，并将细胞的密度都调整为 2×106个/mL。

② 在无菌超低吸附 96 孔板的共孵育孔中加入 15 μL（3×104个）CFSE 标记的肿瘤细胞，按照 1：1、3：1、9：1 的效应细胞：靶细胞比例（效靶比，E:T）分别加入 15、45、135 μL NT、NKG2D-CAR T、IL-4R/IL-15R-NKG2D-CAR T 细胞，每个孔中补齐 X-VIVO 基础培养基至 200 μL，吹打混匀后静置培养 16 h。不同效靶比、靶细胞、效应细胞的样品做三个平行重复以排除实验误差。在另外 3 个孔中只加入 15 μL CFSE 标记的靶细胞，加入 X-VIVO 基础培养基补至 200 μL，作为靶细胞自发凋亡对照组。

肿瘤细胞凋亡的检测

T 细胞与肿瘤细胞共培养 16 h 后，收集细胞，每个样品加入 1 mL PBS，1200 rpm 离心 3 min，小心吸去上清，再加入 1 mL PBS，1200 rpm 离心 3 min，吸去上清后，加入 100 μL 1×Annexin V binding buffer 和 0.5 μL Annexin V 抗体后，重悬细胞，避光室温染色 15 min，加入 1 μL PI 染料（100 μg/ mL），混匀，避光静置 5 min。加入 200 μL 1×Annexin V binding buffer，将细胞悬液过滤，尽量在 1 h内使用流式细胞仪检测完毕。分析存活的（AnnexinⅤ-PI-）肿瘤细胞的比例，评估 T 细胞的细胞毒性。

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