国内中医药领域学者首次以通讯作者在Nature Plants发表论文

来源：自然植物

2022年12月15日，中国医学科学院药用植物研究所联合中国中医科学院中药研究所、成都中医药大学和法国图尔大学在《自然》系列期刊Nature Plants上发表题为“Single-cell RNA sequencing provides a high-resolution roadmap for understanding the multicellular compartmentation of specialized metabolism” （单细胞RNA测序为次生代谢的多细胞区室化研究提供了高分辨率路径图）的研究论文，这是国内中医药研究领域学者首次以通讯作者在Nature Plants上发表论文。该研究成功获得首个重要药用植物单细胞转录组图谱-长春花叶片单细胞转录组图谱，揭示了长春碱生物合成途径在叶片中的空间分布规律，为研究植物药和中药有效成分的生物合成、转运和储存机制开辟了新途径。本研究将药用植物有效成分生物合成研究从线性一维拓展到三维空间，从组织器官深入到单细胞水平，从而提升我们对有效成分合成、转运和储存机制的研究能力，并为药用植物分子育种和合成生物学研究提供更多的潜在靶点。

长春花（Catharanthus roseus (L.) G. Don）为龙胆目夹竹桃科半灌木或多年生草本植物。长春花原产于非洲马达加斯加岛，目前已成为世界各地广泛栽培的一种花卉植物。长春花能够合成130多种单帖吲哚生物碱（MIA），其中包括抗癌药物长春碱和长春新碱，以及降压药物阿吗碱和蛇根碱等，因此，长春花被认为是研究MIA生物合成的模式植物。该研究通过建立和优化适用于次生代谢途径空间分布研究的单细胞转录组测序和分析流程，构建了高质量的长春花叶片单细胞转录组图谱。通过定位途径基因转录本的空间分布，发现单萜吲哚生物碱合成具有区室化现象。该途径起始于内部韧皮部相关薄壁细胞，途径的中间步骤多发生在表皮细胞中，后期的反应多发生在异形细胞中。次生代谢的区室化可以有效降低酶的底物抑制效应、控制代谢流的大小和方向、减轻中间产物的细胞毒性，分散细胞的代谢负担，对植物的生存和环境响应具有重要作用。本研究对长春碱生物合成途径中所有基因表达进行了空间定位分析，并通过RNA原位杂交技术对部分基因的表达定位进行了验证，表明基于单细胞转录组的基因表达定位技术具有极高的准确性，是研究植物次生代谢空间分布的有力工具。此外，作者还发现多个细胞特异性的转运蛋白可能参与了单萜吲哚生物碱的细胞间或细胞内的跨膜转运过程。单萜吲哚生物碱转运蛋白是分子育种和转运蛋白合成生物学研究的潜在靶点。

单细胞转录组测序与数据预处理 首先通过PacBio长读长测序，BioNano光学图谱和HiC等技术构建了染色体水平的长春花参考基因组，为单细胞转录组的数据分析奠定了坚实的基础。然后利用酶解法从幼嫩的长春花叶片获得高质量的原生质体，细胞存活率达到95%以上，来自于三个生物学重复的共计65,000个原生质体用于单细胞转录组文库的构建。利用10×Genomics chromium平台进行文库构建，并用Illumina高通量测序仪进行测序，共获得550.62 Gb转录组测序数据。利用Alevin进行基因表达定量和数据分析，共获得40,530个细胞，所有细胞中表达基因的中位数为2,239个，UMI个数的中位数为5,931个。去除基因数目和UMI异常的细胞及线粒体基因比例大于3%和叶绿体基因比例大于40%的细胞后，共得到34,392个高质量细胞。

细胞分群与注释 通过降维和分群，所有细胞被分为14个细胞群，利用标记基因对细胞群进行注释，发现6号和9号群同时含有表皮细胞（epidermal cell，EC）和气孔细胞（guard cell，GC）的标记基因，因此对这两个群进行进一步亚群分析，并根据标记基因将这两个群的细胞重新划分为幼嫩的表皮细胞（EC1）、成熟的表皮细胞（EC2）和GC。最终在长春花叶片单细胞转录组中共鉴定到7种细胞类型，分别是增殖细胞（proliferating cell，PC）、叶肉细胞（mesophyll cell，MC）、内部韧皮部相关薄壁细胞（internal phloem-associated parenchyma cell， IPAP）、异形细胞（idioblast cell，IC）、维管束细胞（vascular cell，VC）、EC细胞和GC细胞。7号群因缺乏标记基因被名为未知类群（unknown，UN）。利用RNA原位杂交技术对MC、IPAP、EC和VC身份进行验证，证实了分群和注释结果的准确性（图1）。此外，研究人员还比较了长春花和拟南芥叶片的单细胞转录组数据集，不仅验证了长春花细胞分群和注释的准确性，也证实了双子叶植物叶片进化的保守性。其中，跨物种细胞群聚类相关性分析显示长春花的UN与拟南芥MC具有较高的相关性，细胞聚类分析发现在UMAP图中UN与MC相邻，这些结果都表明UN可能是一种叶肉细胞。

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图1 长春花叶片细胞类型的注释与验证

MIA生物合成的多细胞区室化 利用单细胞转录组数据对MIA途径基因在不同细胞类群中的表达进行定量分析，发现甲基赤藓糖醇（MEP）途径和环烯醚萜途径的前七步反应是在IPAP中完成的。而大多数甲羟戊酸（MVA）途径的酶基因主要在EC中表达。说明MIA骨架中的萜类部分可能是主要通过MEP途径合成的。MIA合成途径的中间部分主要在EC中合成，包括从马钱苷酸甲基转移酶到长春质碱合酶和水甘草碱合酶的10余个酶，以及色氨酸脱氢酶。文多灵途径的前几个步骤主要在EC中完成，最后两步在IC中完成。其他MIA分支途径的酶基因多在IC中高表达（图2）。MIA在长春花叶片中的多细胞区室化合成需要多个中间产物转运蛋白的参与。目前已知的参与次生代谢产物转运的转运蛋白主要分布在ABC（ATP-binding cassette transporter）、NPF（Nitrate/Peptide family）、MATE（Multidrug And Toxic Compound Extrusion Family,）和PUP( Purine permease family)等4个家族。在长春花叶片单细胞转录组中共发现62个ABC、27个NPF、27个MATE和13个PUP基因。通过细胞特异性表达分析和系统发育分析发现2个ABC、2个MATE和4个PUP可能参与了MIA中间产物的转运。该研究推测表皮细胞特异性表达的CrMATE1可能参与裂环马钱子苷从胞质到液泡的转运；而CrABCG8可能负责参与中间体的跨EC细胞膜外排。多个PUP家族蛋白可能参与了中间体从IC或EC胞外到胞内的运输；推测CrMATE16在IC中可能负责中间体从胞质到液泡内的运输。此外，两个已鉴定的长春花MIA转运蛋白CrNPF2.9和CrTPT2都显示出EC特异性的表达，这与它们所鉴定的转运功能相一致，CrNPF2.9在EC中可将异胡豆苷从液泡转运到胞质中，而CrTPT2负责将EC中的长春质碱转运到细胞外的蜡质层。

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图2 单萜吲哚生物碱的区室化合成

ECs与VCs发育轨迹的重建 研究人员还对VC和EC进行了拟时序分析，重建了两种细胞的发育轨迹，揭示了发育过程中关键基因的表达变化。通过细胞亚群分析将EC分为5个细胞亚群，并构建EC的发育轨迹（图3）。在发育轨迹起始阶段富集的基因主要参与分生组织生长调节和细胞生长过程，符合早期发育的表皮细胞的生理状态，而在轨迹末端功能富集的基因主要参与蛋白质磷酸化和非生物应激反应，这与成熟表皮细胞响应环境刺激的高敏感性相一致。分析MIA合成基因在表皮发育过程中的动态表达模式，发现大多数在EC中特异表达的MIA基因在EC发育的早期细胞中表达水平较高，沿轨迹表达量持续下降，其中TDC、CS、16OMT和T3O的表达大幅下降，在轨迹末端（成熟的EC）很少表达，只有PRX在EC发育后期表达水平略高。这一现象表明，在EC特异表达的MIA基因的活性受到EC发育的紧密调控。此外，研究人员构建了VC细胞发育轨迹，以了解VC群内的细胞分化状态（图3）。首先，将VC划分为6个亚群，其中8_1亚群被注释为原形成层细胞，而8_2和8_5被注释为伴胞(companion cell, CC)。基于8_1、8_2和8_5亚群细胞构建了从原形成层到CC连续分化的伪时间轨迹。轨迹两端基因的GO富集分析显示，轨迹起点富集的基因信号与原形成层相关生理功能的细胞增殖和核小体组装等过程一致，而糖的吸收，离子运输以及能量需求等过程均在轨迹末端富集，这和伴胞的生理功能一致。

图3 EC和VC发育轨迹重建

该工作得到中国医学科学院创新工程项目的资助。中国医学科学院药用植物研究所孙思杰（研究生）、沈晓凤（博士后）和李益（研究生）为文章共同第一作者；法国图尔大学Benoit St-Pierre教授、中国中医科学院中药研究所和成都中医药大学陈士林研究员、中国医学科学院药用植物研究所孙超研究员为文章共同通讯作者。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41477-022-01291-y；https://www.nature.com/articles/s41477-022-01292-x

转自：“如沐风科研”微信公众号

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