原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是全球第6大常见癌症，也是世界上死亡率最高的癌症之一[1]，肝癌患者的死亡率很高，全世界每年报告死亡人数近80万[2]。目前对于肝癌的治疗方法通常为手术切除、肝移植、序贯射频消融（radiofrequency ablation，RFA）、肝动脉化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）和靶向治疗、免疫治疗等[3]。靶向治疗如索拉非尼能够延长晚期肝癌患者的生存时间，然而其不良反应以及耐药性限制了肝癌的临床疗效[4]。而由于肿瘤的免疫微环境错综复杂，故单抗法治疗的缓解率并不理想[5]，因此逆转耐药、诱导癌细胞死亡则是未来的可能方向之一。近年来，细胞死亡是一个研究热点，其分为坏死、细胞焦亡、铁死亡等[6]。肿瘤细胞中细胞焦亡的发生，可以增强化疗效果，逆转耐药，而中医药作为天然药物，其活性成分治疗则具有低毒性、安全、多靶点等优点，并且其能够影响细胞焦亡的进程[7-8]，因此研究中医药调控细胞焦亡基因表达有重要意义，其不仅在从中药活性成分中开发抗肝癌药物方面作用显著，还可通过网络药理学以及现代医学的研究方法丰富中医理论。
1 资料与方法
1.1 数据来源
从TCGA网站中下载肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）的转录组数据，用于基因表达量分析；在GeenCards数据库中得到细胞焦亡的相关基因名称；使用Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）数据库进行基因的预后分析；使用R语言进行基因本体论（gene ontology，GO）、DO（diease ontology）分析；使用Comparative Toxicogenomics Database（CTD）数据库查找可调控目标基因的化学成分。最后通过COREMINE数据库查找包含化学成分的中药，并统计性味归经以及药物分类。
1.2 方法
1.2.1 差异基因分析 使用R语言ver 4.0.5分析肝癌转录组测序数据，获得在肝癌中细胞焦亡相关基因的表达量，并绘制细胞焦亡差异基因在正常组与肿瘤组的热图。
1.2.2 基因共表达网络 将细胞焦亡差异基因以差异倍数（fold change，FC）的对数值（logFC）降序排列，选取前10与后10位差异基因进行相关性分析并绘制共表达热图。
1.2.3 关键基因临床相关分析 使用GEPIA数据库分析细胞焦亡基因表达水平与肝癌的生存时间的相关性。
1.2.4 GO功能富集分析 将得到的细胞焦亡基因进行GO富集分析，分析基因产物承担的生物学过程、执行功能时所处的细胞结构位置。
1.2.5 DO疾病分析 将得到的细胞焦亡基因进行DO疾病分析，分析基因与其余疾病相关程度。
1.2.6 中药预测与分析 将细胞焦亡基因提交至CTD数据库，查找能够调控基因的化学成分，经规范后统计对应中药较多的11种基因，查找文献并且参考CTD数据库文献支持数较多的化学成分，在COREMINE数据库中寻找包含对应化学成分的中药名称。根据《中国药典》《中药大辞典》《中华本草》《中药学》对中药的性味归经以及药物分类进行统计。
2 结果
2.1 细胞焦亡差异基因分析
以“pyroptosis”为关键词在GeenCards数据库中搜索，得到细胞焦亡相关基因，并提取基因在肝癌以及正常组织中的表达量，选取P＜0.001的基因，筛选出86个上调基因和19个下调基因，绘制细胞焦亡相关基因热图，如图1所示。图中左边蓝色部分为正常组，右边粉色部分为肿瘤组，红色为高表达基因，蓝色为低表达基因。从图1中可看出，细胞焦亡基因在肿瘤组多为高表达。
2.2 基因相关性分析
将细胞焦亡的差异基因进行相关性分析，以logFC值降序排列，选取差异基因中前后排名前10的基因进行相关性分析，如图2所示。图中横纵坐标均为基因的名称，上半部分是通过圆圈的大小和颜色深浅代表相关性，蓝色越深，代表在研究中2个基因之间正相关性越强，最高为1；红色越深则代表负相关越强，最高为−1。下半部分则直接通过数值代表相关系数。由图2可知，20种基因的相关性最高相关系数为0.37，最低相关系数为−0.26，表明细胞焦亡相关基因仍有正负相关。
2.3 细胞焦亡相关基因预后分析
在105个基因中保留logFC在1.0以上及−1.0以下的部分，得到53个细胞焦亡基因，将其提交至GEPIA数据库，进行肝癌临床生存分析，将P＜0.05的基因保留，称为预后相关基因，并绘制临床生存分析图，如图3所示。说明细胞焦亡基因的表达量与肝癌的生存时间有明显相关。
2.4 细胞焦亡GO富集分析
将得到的肝癌中差异表达的细胞焦亡基因进行GO富集分析。选取矫正后P＜0.05，并分别在生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）中排名前10位的功能绘制GO富集分析图（图4），图中以圆圈大小和颜色深浅反映富集程度以及矫正后P值大小，由结果可知，筛选出的细胞焦亡基因在BP中与脂多糖反应、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、白细胞介素等炎症反应相关；在CC中主要与膜、受体相关；在MF中主要与半胱氨酸酶、细胞死亡等过程有关。
2.5 细胞焦亡相关基因DO疾病分析
将得到的肝癌中差异表达的细胞焦亡基因进行DO疾病分析，选取矫正后P＜0.05的疾病，并以矫正后P值升序排序，选取前30位相关疾病，并绘制DO富集分析图，如图5所示，图中左侧为疾病名称，右侧底部数字代表富集在本疾病中的基因数目。由图5可知，细胞焦亡相关基因与多种疾病有关，其中多为感染、炎症等相关疾病。
2.6 预后相关基因对应中药统计
将与预后相关的细胞焦亡基因提交至CTD数据库，检索对于基因有调控作用的化学成分，查阅文献以及选择CTD数据库中文献支持度较高的化学成分。将化学成分提交至COREMINE数据库，检索包含对应化学成分的中药，选择P＜0.05的中药，共筛选出1223味中药，出现频次9377次。根据《中国药典》《中药大辞典》《中华本草》《中药学（第10版）》等工具书对于出现频次在10次以上的中药进行统计，共筛选出324味中药。由于部分药物没有明确的性味归经，故对于中药的不同属性进行分别统计。四气301次，寒（96）＞温（89）＞平（80）＞凉（30）＞热（6），如图6所示；五味475次，苦（151）＞甘（133）＞辛（103）＞涩（35）＞酸（24）＞咸（19）＞淡（10），如图7所示；归经：肝（123）＝肺（123）＞脾（107）＞胃（96）＞肾（70）＞心（61）＞大肠（54）＞膀胱（22）＞胆（10）＞小肠（7）＞心包（6）＞三焦（2），如图8所示。有明确药物分类的中药共154味，补虚药（29）＝清热药（29）＞化痰止咳平喘药（13）＞解表药（10）＝理气药（10）＞活血化瘀药（9）＞利水渗湿药（8）＝收涩药（8）＝止血药（8）＞温里药（7）＞祛风湿药（4）＝泻下药（4）＞化湿药（3）＝平肝熄风药（3）＝消食药（3）＞安神药（2）＝驱虫药（2）＞攻毒杀虫止痒药（1）＝开窍药（1），如图9所示。进一步选择B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）、bcl-2同源拮抗剂杀手蛋白（Bcl-2 antagonist killer 1，BAK1）、核苷酸结合寡聚结构域1（nucleotide-binding oligomerization domain 1，NOD1）基因单独进行归经（频次）统计，结果表明BAX与肺（124）、肝（123）、脾（106）、胃（96）、肾（70）相关性最强；BAK1与肺（109）、肝（108）、脾（95）、胃（82）、肾（60）相关性最强；NOD1与肺（37）、胃（34）、肝（33）、脾（30）、肾（15）相关性最强，如图10所示。部分基因对应的中药见表1，部分高频中药见表2。
3 讨论与展望
调节性细胞死亡（regulated cell death，RCD）在生理情况下又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。其中包括几种死亡方式，如细胞凋亡、自噬、铁死亡等[9]。其中细胞焦亡是一种特殊的细胞死亡形式，其过程依赖半胱氨酸天冬氨酸酶-1（cysteine aspartase-1，Caspase-1）、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）等分子导致细胞肿胀破裂，细胞内容物释放，进而产生强烈的炎症反应[10-11]。研究表明，细胞焦亡对于脂肪肝、肝硬化、肝癌等肝脏疾病均为重要因素[12-13]。而在形成肝癌前，细胞焦亡产生的炎性小体及因子能促进肝癌的发展；在肝癌形成以后，细胞焦亡水平下调，或可促进肝癌的发展[14]。然而，细胞焦亡在肿瘤中的作用仍有很大争议[15]，有待进一步研究。细胞焦亡可被多种方式诱导发生，如化疗药物、细菌内容物、病毒感染、人体的部分调节因子等[16]，其过程则有经典及非经典途径，经典途径细胞焦亡主要通过Caspase-1调控，非经典途径细胞焦亡则通过Caspase-4/5/11通路调控[17-18]；同时还有Caspase-3、Caspase-8等途径[19]。BAK、Bax的激活不仅可直接介导肝炎，而且可在化疗诱导通过BAK/Bax-Caspase-3-消皮素E（gasdermin E，GSDME）途径介导细胞焦亡[20-22]。GSDME多被认为是一种抑癌基因[23]，当GSDME高表达时，Caspase-3可切割GSDME引发细胞焦亡，细胞焦亡增强了药物敏感性，降低了肿瘤细胞的抗凋亡特性，增强疗效[21]，故而BAX-Caspase-3-GSDME通路在肿瘤的发育和治疗中起着重要的作用。NOD1则与炎症、免疫密切相关，且与多种肿瘤中的细胞焦亡过程以及诊断、预后相关[24-25]。
中药单体成分以及中药复方均可调控细胞焦亡，如丹皮酚预处理可下调核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）/Caspase-1介导的细胞焦亡过程，保护心肌组织[26]；积雪草酸能够协同增强奥沙利铂对结肠癌细胞的增殖抑制、促凋亡、自噬、细胞焦亡作用[27]。而中药复方研究，如大黄牡丹汤可抑制NLRP3/Caspase-1通路，治疗炎症性肠病[28]。有学者研究细胞焦亡的病理生理过程，将肝癌发生发展过程中的免疫功能降低与中医理论中“正虚”、增殖转移与“癌毒”、血液高凝状态与“瘀血”相互结合，提出“虚瘀毒”理论与肝癌细胞焦亡的关系，并提出益气化瘀解毒类中药可能会影响细胞焦亡过程而发挥作用[29]。
本研究通过分析TCGA数据库肝癌细胞焦亡差异基因的表达，得到能够调控基因的化学成分，并通过化学成分查找相关中药，总结中药性味归经及药物分类，最后将3种基因通过化学成分与中医理论相结合，得出与肝癌细胞焦亡有关的四气为寒、温、平；五味为苦、辛、甘为主；说明对于肝癌本身，祛邪多应用苦寒药物，而扶正方面则注重以辛甘化阳法补虚，辛味药不仅在人体正虚时促进阴阳互长互生，更可使苦寒药物达到寒而不滞的效果，避免寒凉伤正。整体归经统计以肝、肺、脾、胃、肾经为主。基因与归经的相关性分析发现，单个基因与疾病整体归经趋势大致相同，可说明微观基因层面与宏观整体调控变化相一致。而单个基因归经中肺经药物出现频率大于肝经，但差距不大，其可能原因是中医理论中气机升降由肝肺二者共同所主，许多理气药及化痰药常归经于肺经，而胃经多于肝经，可能是与中医理论中“胃气”相关性较强所致，后续有待进一步分析。药物分类统计以补虚药、清热药、化痰药、解表药、理气药、活血化瘀药、利水渗湿药为主。其药物对应的病机与中医理论中对于肝癌的病机认识大致相同，以此或可证明中医性味归经、药物分类理论有明确的物质基础。
本研究通过细胞焦亡差异表达基因探寻相关的中药，并将基因与归经进行关联，发现微观层面的基因与中医整体观念指导下的用药是一致的，可以从微观和宏观层面进一步丰富中医理论，并深入挖掘中医经典中可能存在的微观机制。因此，这2个层面的互相印证对于完善和发展中医药理论有重要意义。然而本研究仍存在以下不足：（1）本研究仅统计频数在10次以上的中药名称及性味归经、药物分类，或可进一步扩大统计范围；（2）本研究通过调控成分统计相关中药，但其是否能够调控细胞焦亡仍需进一步进行实验验证及临床观察。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：张道平，姚昆鹏，刘起立，李峥嵘，陈沛儒，彭建平．基于生物信息学探讨肝癌相关细胞焦亡基因及潜在中药预测 [J]. 中草药, 2022, 53(23):7467-7476.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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