背景：
基于CRISPR的技术代表了生物医学科学的重大突破，因为它们为包括免疫学在内的各个领域的无偏倚筛选和功能基因组学提供了一个强大的平台。汇集和排列的CRISPR筛选揭示了先天和适应性免疫细胞中用于免疫调节的以前未知的细胞内驱动因子，以及介导细胞间相互作用的细胞间调节因子。最近的单细胞CRISPR筛选平台扩展了对转录组的读取，并使我们能够推断基因调控网络，从而更好地了解机制。CRISPR筛查还可绘制遗传相互作用图，从而确定可协同或减轻复杂免疫表型的基因。
简介：
2022年12月8日，来自美国圣裘德儿童研究医院免疫学部的Hongbo Chi 教授课题组在Nat Rev Immunol（IF: 108.5）杂志上发表题为“CRISPR screens for functional interrogation of immunity”的文章[1]。在本文中，作者综述了CRISPR技术的进展和新适应，以增进我们的基础免疫学知识，并为感染、炎症和癌症的免疫治疗寻找新的疾病靶点。
主要结果：
免疫细胞的体外筛选。
为了了解免疫细胞的激活、分化和功能的转录和信号转导过程，以前的研究通常依赖于遗传干扰(例如，使用小干扰RNA或短发夹RNA)或药物抑制。基于CRISPR的基因编辑能够高效生成基因敲除细胞，并且无偏倚地发现免疫应答和疾病的主要调节因子，从而对这些方法进行了补充和扩展。Cas9表达转基因小鼠的发展大大加快了CRISPR筛选在原代免疫细胞中的应用，包括全基因组混合筛选。
固有免疫的细胞内调节因子。
CRISPR筛选在一系列情况下揭示了固有免疫的新分子介质。在报告对原代免疫细胞进行全基因组混合CRISPR筛选的同类研究中，我们用脂多糖(LPS)刺激了来自Cas9转基因小鼠的原代骨髓源性树突状细胞(DCs)，以发现肿瘤坏死因子(TNF)表达的调节因子(图1a)。用全基因组慢病毒sgRNA文库转导骨髓来源的DCs，然后对LPS刺激后高表达TNF和低表达TNF的群体进行流式分选，比较sgRNA在这两个群体中的分布。由于文库覆盖范围有限，为了减少假阴性结果，我们对主要筛选的候选命中基因(>2,500个基因)进行了二次汇总筛选。初步和二次筛选确定了TNF调节因子的三个功能模块，包括已知的Toll样受体4 (TLR4;脂多糖的受体)通路成分以及寡糖转移酶(OST)和聚合酶相关因子(PAF)复合物。虽然详细的机制还需要进一步的研究，这些结果通过建立OST和PAF复合物分别抑制内质网应激和与RNA加工因子相互作用，为LPS-TLR4信号传导提供了一个扩展的观点。人类和小鼠的固有免疫在许多方面存在差异，包括对LPS的反应。最近，我们利用排列的sgRNA文库，在原代人单核细胞来源的树突状细胞中筛选了300个基因，以筛选在LPS刺激下TNF和IL-10表达的特异性调节因子。因此，汇集和排列的CRISPR筛选提供了可靠的平台来识别DC激活所需的信号通路。
适应性免疫的细胞内调节因子。
除了对CD40信号转导和B细胞分化的一些研究外，目前的CRISPR筛选主要集中在T细胞活化、增殖和黏附方面，部分原因是已经建立了研究这些T细胞功能及其在癌症免疫治疗中的重要作用的实验系统。为了探索T细胞活化的机制，我们进行了一项全基因组CRISPR筛选，通过上调人Jurkat T细胞上的活化标志物CD69，确定了T细胞受体(TCR)信号传导的新型调节因子，包括FAM49B，它可抑制小GTP酶RAC的活性和肌动蛋白细胞骨架重组(图1a)。利用包含sgRNA慢病毒感染和Cas9蛋白电穿孔(SLICE)的混合CRISPR - Cas9递送系统，在人CD8+ T细胞中进行的全基因组混合CRISPR筛选确定了增殖调节因子(图1a)，包括CD5、CBLB和RASA2，靶向这些调节因子具有增强T细胞功能的治疗潜力。此外，这些调节因子中的大多数都通过使用单个rnp电穿孔的阵列CRISPR筛选进行了验证。因此，如SLICE所示的杂交系统允许原代人T细胞表达Cas9，这有助于体外的混合筛选。此外，在免疫抑制条件下(包括腺苷，环孢素或转化生长因子-β)培养的人T细胞中，利用多个全基因组CRISPR筛选确定RASA2是T细胞增殖的负调节因子。在机制上，RASA2消融增强了MAPK信号传导和嵌合抗原受体(CAR) T细胞的体外细胞溶解活性。总之，这些研究表明，这些新的调节因子可能是有希望的靶点，以增强T细胞治疗癌症的持久性和效应功能。
细胞-细胞相互作用的细胞间调节因子。
1型传统树突状细胞(cDC1s)是最有效的树突状细胞亚群，可将抗原交叉提呈给初始CTLs。我们在初级cDC1s中进行了阵列CRISPR筛选，以确定不同的基因扰动如何影响CD8+ T细胞的抗原依赖性增殖(图1d)。具体而言，用表达靶向cDC1高表达基因的sgRNAs的逆转录病毒转导来自Cas9转基因小鼠的cDC1祖细胞，然后进行cDC1分化，并检测向抗原特异性T细胞交叉呈递的变化。调控细胞内囊泡运输的WDFY4被确定为cDC1交叉呈递的正调节因子，并随后在体内进行了验证。
图1：免疫细胞活化和功能的体外CRISPR筛选
免疫细胞的体内筛选。
体内复杂的细胞和微环境信号对免疫细胞的激活、分化和功能产生影响，而这些影响在体外很难模拟。在体内研究细胞类型特异性基因功能最常用的方法之一是条件敲除小鼠的生成和分析，但这种策略通量低且耗时。为了克服这些局限性，在体内小鼠模型中进行的基于CRISPR的遗传筛选(图2)(作者开发了多种表达Cas9或表达dCas9的小鼠1)正在揭示免疫细胞命运和功能在感染、炎症和癌症中的调节机制，并推进免疫治疗。在此，我们总结了近年来CRISPR在免疫系统中的研究，主要是在T细胞对感染、炎症和肿瘤的反应。
图2：体内CRISPR在免疫细胞和肿瘤细胞中筛选免疫应答的调节因子
利用免疫压力进行肿瘤筛查。
免疫检查点阻断(ICB)和CAR T细胞疗法是诱导对肿瘤产生强烈免疫应答的强大策略。然而，只有一小部分患者对ICB有效，最初有效的患者可能会出现治疗耐药;此外，实体瘤通常对CAR T细胞介导的杀伤无效。肿瘤进化出多种逃避免疫应答的机制，包括抗原呈递减少、对IFNγ的反应性受损和某些致癌通路的激活，这些机制通常是通过将肿瘤基因特征与免疫特征或ICB治疗应答相关联而发现的。识别新的癌症诱导的免疫抑制机制对于揭示肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用和实现更好的抗肿瘤免疫至关重要。最近的CRISPR筛选揭示了抑制抗肿瘤免疫反应的新机制。
图3：整合基因调控网络分析与CRISPR筛选
通路定位和遗传相互作用。
联合治疗正在成为一种有希望的癌症治疗策略，但确定与当前治疗方法共同靶向的候选药物仍然具有挑战性。对遗传相互作用的研究，包括协同和缓解(也称为缓冲)效应，有助于推断生物途径中的新组分及其关系。CRISPR技术能够在整个信号通路中干扰候选分子以确定其免疫功能。例如，我们使用基于CRISPR的基因编辑技术，分别单独或联合删除了CD4+ T细胞和CD8+ T细胞内胞苷-5 ' -二磷酸(CDP) -乙醇胺和鸟苷-5 ' -二磷酸(GDP)聚焦通路中的多个基因，这有助于分析相互作用和与免疫信号传导过程的交互作用。基于CRISPR的类似通路定位策略也被用于干扰CD8+ T细胞分化和功能中SWI/SNF染色质重塑复合体的多个组分。CRISPR介导的基因编辑对候选分子的通路水平的扰动不仅可以用于验证CRISPR筛选中确定的功能成分，而且可以揭示不同成分对表型的相对贡献。然而，要确定多个基因如何在免疫细胞中相互作用，需要对单独干扰或联合干扰一对基因的表型结果进行系统性比较。
图4：基于CRISPR的免疫调节遗传相互作用筛选
结论和展望：
CRISPR筛选是一种强大的前沿遗传工具，可用于确定不同生理环境下免疫细胞激活、分化和功能的新颖机制，以及确定肿瘤-免疫相互作用的特征。然而，由于有可靠的实验系统，特别是TCR-转基因小鼠，因此迄今进行的大多数体内免疫细胞筛选都使用了T细胞。鉴于体内筛选的优势，新的体内CRISPR递送系统，如CHIME, iMAP和RNP核转染，应扩大CRISPR筛选在其他细胞类型的应用，如自然杀伤细胞，巨噬细胞，树突状细胞和B细胞。免疫应答的异质性和基因调控网络的背景特异性重组难以批量CRISPR筛选来解决。从这个角度来看，scCRISPR筛选提供的丰富的转录组信息，以及它们在研究基因调控网络、下游机制和遗传相互作用方面的能力，可能会推动CRISPR筛选在免疫系统中提供的生物学见解。
基于CRISPR的基因编辑是靶向T细胞用于癌症治疗的强大手段，CRISPR筛选肿瘤和感染模型中T细胞应答的调节因子在识别具有直接临床相关性的靶点方面具有巨大潜力。值得注意的是，由于T细胞功能有限、长期存在以及肿瘤介导的对这些细胞的抑制，ICB和过继细胞疗法可能只对一部分癌症患者有效。因此，我们需要更好地理解肿瘤中潜在的T细胞耗竭的细胞和分子异质性，这可以通过scCRISPR筛选方法来解决。此外，从CRISPR筛选中获得的遗传交互作用研究信息可以为研究使用多重遗传扰动方法进一步改进癌症的组合治疗策略提供基础，Cas12a等组合筛选工具的开发将加速这一过程。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41577-022-00802-4
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