背景：
近年来，非凡的技术进步使我们能够从患者血液样本中识别和检测罕见的循环肿瘤细胞(CTCs)，这带来了新的研究领域，并为基于液体活检的临床应用带来了改变范式的希望。对CTCs的分析揭示了不同的生物学表型，包括CTC簇的存在以及CTC与免疫细胞或基质细胞之间的相互作用，影响转移形成，并提供了关于癌症脆弱性的新见解。
简介：
2022年12月9日，来自瑞士苏黎世联邦理工学院分子健康科学研究所生物系的Nicola Aceto教授课题组在Nat Rev Cancer（IF: 69.8）杂志上发表题为“Biology, vulnerabilities and clinical applications of circulating tumour cells”的文章[1]。本文就CTCs生物学特性的研究进展作一综述，以期为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。
主要结果：
CTCs转移的进展。
转移性癌症播散的模式。
转移是通过肿瘤细胞直接进入血管或淋巴系统，以及(较少见的)直接扩散到邻近组织发生的。虽然肿瘤，淋巴结和转移(TNM)分期系统使用阳性淋巴结状态作为晚期癌症的标志，但迄今为止，有限的实验证据表明癌细胞必须穿过淋巴系统才能产生远处转移。相反，大量文献支持血行途径是主要转移途径。虽然几十年的科学研究已经揭示了导致原发性肿瘤形成的详细的发病机制，但对转移性疾病的生物学基础仍不充分了解。然而，在过去20年里，在阐明这方面的关键方面取得了重要进展。转移是一个多步骤的过程，取决于原发肿瘤(或转移病灶)中具有侵袭性和转移能力的细胞克隆，这些细胞克隆通过血管内渗逸出，并作为CTCs在血流中传输。当CTCs到达外渗点时，可归巢到远处的龛位并生长为继发性病变。癌细胞播散的两种机制模型被提出:(1)线性或晚期播散模型和(2)平行进展或早期播散模型。
转移事件的逐步顺序。
转移性播散的第一个关键步骤是癌细胞侵袭，然后是向近端血管的内渗(图1a,b)。进入循环可通过被动脱落或主动细胞侵袭实现。在被动脱落的情况下，肿瘤流体动力学和不成熟肿瘤新生血管的屏障功能降低促进了肿瘤细胞的物理排出到外周。然而，导致肿瘤细胞被动脱落的频率和确切条件仍然知之甚少。缺氧可以触发活跃的癌细胞侵袭。缺氧诱导因子1α (HIF1α)增加黏附分子L1细胞黏附分子(L1CAM;通过血管生成素样蛋白4 (ANGPTL4)信号传导)和CXC趋化因子受体4 (CXCR4)，导致CTC-内皮结合和内渗增强。通过上调细胞-细胞黏附分子，缺氧进一步与CTC簇的形成和内渗相关(图1a)。内皮细胞表达的HIF脯氨酰羟化酶2 (HIFPH2)通过阻碍内皮完整性和血管成熟促进肿瘤细胞逃逸到血管中。肿瘤细胞与血管周围巨噬细胞的短暂结合通过血管内皮生长因子A (VEGFA)的产生进一步增加内皮的通透性，这种方式不依赖于HIF1α。
CTC生物学的物理和代谢特征。
肿瘤的力学和物理特性与癌细胞的状态和功能、肿瘤的进展和转移有着错综复杂的联系。通常情况下，由于细胞外基质的变化，肿瘤比健康组织更硬。刚性可以导致基因表达的改变，促进肿瘤细胞的运动，而垂直排列有利于扩散(有时被称为肿瘤细胞侵袭的“高速公路”)。有渗漏的肿瘤血管可导致液体积聚，再加上快速增长的肿瘤块存在空间限制，从而导致高组织间压力和血流梯度，为肿瘤细胞逃逸创造了允许的途径。癌细胞可以通过重新利用细胞核来产生静水压力，通过肌动球蛋白的收缩作用拉动和释放细胞核(类似于发动机活塞)，从而主动迁移。来自肿瘤微环境的机械刺激通过Yes相关蛋白1 (YAP)转录共激活因子与PDZ结合基序(TAZ)依赖的癌症相关成纤维细胞(CAF)激活和增强细胞侵袭和迁移促进转移。一旦进入血流，CTCs会经历不同水平的剪切力，高水平的剪切力会导致细胞碎裂，中等水平的剪切力会促进内皮黏附和外渗。
图1：转移级联的逐步进展
CTCs的生物学特征。
CTC表型异质性和CTC簇。
上皮细胞通常在与周围环境失去联系后发生失巢凋亡;因此，转移性种植通常无效。因此，这就提出了以下问题:CTCs具有哪些特性支持其成功转移性播散?一小部分具有干性的肿瘤起始细胞或转移起始细胞似乎具有增强的生存和肿瘤种植能力。EMT被认为是转移的关键条件，因为它可以提高非接触依赖性生存率(即抗失巢凋亡)和侵袭性。临床前研究表明，EMT转录因子，如SNAIL和TWIST，在体外抑制细胞-细胞接触，增加运动性和侵袭性。然而，沉默SNAIL和TWIST可以减少但不能完全抑制体内转移，挑战了EMT相关转录调节因子在转移过程中的必要性。
CTCs的分子异质性。
CTCs是动态的细胞群，从多个肿瘤区域和解剖位置不断补充，从而能够快速评估肿瘤异质性。通过研究CTCs的基因组学、转录组学和表观遗传学特征，我们可以进一步探索其生物学特性。单细胞技术和复杂的生物信息学工具的发展使我们能够以单细胞分辨率对罕见的CTC群体进行分析。例如，单CTC分析发现，拷贝数变异体、治疗靶点(如HER2)和耐药突变(如PIK3CA)仅与来自同一患者的原发肿瘤或转移病灶部分重叠。动态调控CTCs中的HER2表达与原发肿瘤中的HER2表达不同:HER2阳性的CTCs可能激活多个冗余通路(如胰岛素受体、MET和IGF1)，而HER2阴性的CTCs激活Notch和DNA损伤成分。突变确定的易转移CTC亚克隆与原发肿瘤有相似之处，但也有不相同的改变，包括调节运动蛋白编码基因的突变[例如动力蛋白轴突重链8 (DNAH8)、ephrin B受体1 (EPHB1)、微管-肌动蛋白交联因子1 (MACF1)和神经前体细胞表达的发育下调蛋白9 (NEDD9)]。Wnt和Notch等干细胞样信号通路的激活以及NK2同源盒1 (NKX2-1)缺失导致的去分化进一步增强了CTCs的转移潜能。
图2：循环肿瘤细胞群的生物学特征
CTCs的检测和分析。
将CTCs作为液体活检分析物应用于临床需要无偏倚、有效、快速和负担得起的捕获技术，从而可靠地分离出足够数量的CTCs。这些捕获技术还必须与先进的测序工具和功能分析兼容，从而生成数据，用于准确的患者分层和治疗决策(图3a)。当以可行形式分离出CTCs时，我们还可以对转移性癌症的生物学和脆弱性进行一系列特别的分子和功能研究(图3a)。由于CTCs可能代表具有高转移倾向的侵袭性亚克隆，因此CTCs作为液体活检分析物发挥了独特的作用。我们推测，与经典组织活检(分离随机亚克隆)或其他循环分析物(如循环肿瘤DNA)分析(检测死亡亚克隆)相比，它们的表型和分子分析可能揭示更多相关信息。然而，这需要进一步研究。通过微创抽血可频繁、纵向评估临床干预的效果，并有可能早期发现癌症或复发。这使得CTC成为实时临床应用和个体化医疗的理想生物标志物来源。然而，由于CTC的稀有性质，捕获CTC仍然具有挑战性，而高效的CTC富集对于可重复性的下游分析和应用至关重要。
图3：循环肿瘤细胞捕获，分析和临床试验设计
基于CTC的临床应用。
CTCs的缺点和靶向。
目前消除转移的策略与应用于原发肿瘤的策略相同:靶向生长和肿瘤发生而不是转移过程本身。原发肿瘤的手术或全身治疗不一定能清除转移源，因为可能已经发生了播散。大多数抗肿瘤药物最初在转移性疾病中进行试验，然后在辅助治疗中重复使用，以预防转移性疾病，但只有部分成功。一些临床前研究和未来临床试验设计的思路对真正靶向转移的药物的缺乏提出了挑战。
在临床前模型中，有人提出使用血管复常诱导剂(例如可精细调节VEGF受体(VEGFR)信号传导的ephrin B2 Fc嵌合体蛋白)靶向缺氧诱导的簇释放可作为预防转移的策略41(图4a)。PLK1抑制剂BI 2536也可预防CTC内渗，因此其临床应用可提供一种抑制转移扩散的方法(图4a)。靶向整合素、钙黏蛋白和细胞表面糖蛋白、靶向侵袭性伪足(例如通过N-WASP抑制)、靶向CD36和p -选择素的抗体或αIIbβ3和α6β1整合素拮抗剂也可预防内渗和外渗(图4a)。目前正在开发的一类药物旨在抑制HPSE，该药物可诱导ICAM1介导的CTC簇细胞黏附。尿激酶是一种溶解纤维蛋白的溶栓剂，在体外也可抑制CTC聚集，并减少小鼠体内的CTC聚集数量。此外，Na+/K+- ATP酶抑制剂(如地高辛)因其在体内的簇解能力而显示出很大的前景，最终导致小鼠的转移抑制。
CTCs的预后和预测价值。
截至2022年10月10日，ClinicalTrials.gov上以“循环肿瘤细胞”为检索词的366项研究获得了结果，其中218项研究正在进行中，这反映出人们对将CTCs作为精准肿瘤学的生物标志物越来越感兴趣。在此类研究中，CTCs已在所有主要癌症的外周血中检测到，其在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌以及小细胞和非小细胞肺癌中的预后价值已得到证实。在新诊断为转移性乳腺癌的患者中，治疗前CTC计数升高预示着较短的无病生存期和总生存期。据报道，治疗前CTC数量与结直肠癌和前列腺癌患者的临床预后呈负相关。重要的是，数项研究表明，与基线CTC状态相比，治疗后CTC数量的变化提供了更好的预后信息，治疗后CTC持续存在意味着预后较差。在评估单个CTC计数的基础上，CTC簇丰度显著改善了接受治疗患者的预后价值。然而，鉴于这些研究中的大多数是使用抗原依赖性CTC技术进行的，因此在这种情况下进行计数有产生假阴性结果的风险。
图4：循环肿瘤细胞靶向策略
结论和展望：
转移仍然是改善癌症患者结局的一个巨大障碍，因为它相当于大多数癌症相关死亡病例。我们开始对肿瘤细胞在远处种植肿瘤能力的生物学过程有了更深入的了解，部分原因是对CTCs作为血源性转移的前体进行了严格研究。对CTC簇的早期观察和最近对其生物学特征的分析突出了它们的复杂性，但也暴露了它们的脆弱性，因此也有可靶向的机会。CTCs在患者体内的异质性为患者癌症的全面活检提供了一个有趣的替代方案，尤其是考虑到与大部分肿瘤相比，CTCs可能在转移形成细胞中富集。过去10年中出现了大量观察性研究和少量干预性试验，验证了CTCs用于预后和治疗分层。然而，要实现CTCs的全部潜力，需要从单纯的计数和预后发展到高度受控的分子表征，从而开发出精确的预测性生物标志物。技术和创新可能会为增强罕见但宝贵的CTC人群的检测和详细表征铺平道路，从而克服目前的诊断和治疗局限性。
即使是现在，人们仍在努力将转移转移转移成为治疗策略的重点(如转移工作组(metastasis Working Group))。我们转移生物学知识的成功转化，以及在创新的临床试验设计和临床转化框架中实施有效的CTC捕获方法，将大大加强这些努力。我们设想，在未来，CTCs可能通过及时识别侵袭性肿瘤亚克隆(这与设计高效的癌症疗法相关)，在住院患者分层和治疗决策中发挥关键作用。最终，靶向CTCs及其簇可能阻止进一步转移扩散并有利于患者生存。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41568-022-00536-4
转自：“生物医学科研之家”微信公众号
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