背景：
先天性免疫缺陷(Inborn errors of immunity, IEI)是由于基因突变导致的影响免疫系统对抗病原体、应对微生物群或调节自身免疫和炎症的能力的疾病。目前已描述了500多种IEI，其中许多危及生命，需要根治性治疗。异基因造血干细胞移植是一种日益有效的治疗策略，自体基因修饰的造血干祖细胞移植也是一种治疗选择。基因疗法首次成功用于恢复重度联合免疫缺陷患者的T细胞发育，20多年后，经体外工程改造的γ-逆转录病毒载体使T细胞免疫缺陷得到持续纠正。更安全、更强效的载体的产生增加了该疗法对其他IEI(如Wiskott-Aldrich综合征和慢性肉芽肿病)的疗效和应用。然而，基于基因相加的基因治疗有一些局限性，最大的局限性是缺乏生理基因表达调控。
简介：
2022年11月25日，来自法国Necker儿童Malades大学医院儿童免疫血液学和风湿病科的Alain Fischer教授课题组在Nat Rev Immunol（IF: 108.5）杂志上发表题为“Gene therapy for inborn errors of immunity: past, present and future”的文章[1]。本文总结了过去25年成功应用基因疗法治疗IEI的历程，并讨论了该领域的下一步工作。
主要结果：
来自X连锁SCID的经验。
从基因到病理生理机制。
1968年，Gatti等成功地对1例X连锁SCID患儿(SCID-X1)实施了HSCT。这一结果很快被其他临床团队复制。SCID-X1也是第一个通过基因治疗得到纠正的疾病。以T细胞和NK细胞分化缺陷为特征，呈隐性x连锁遗传。该位点定位于X染色体长臂后，编码IL-2受体γ亚单位(IL-2Rγ;也被称为IL-2RG))的克隆，并在SCID-X1患者中发现包含功能缺失突变。这一发现出乎意料，因为γ亚单位不知道参与T细胞和NK细胞的分化。这一明显的矛盾导致最终认识到IL-2RG -更名为“共同γ链”(γc)-实际上是几个细胞因子受体的组成亚单位，即IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15和IL-21的受体。
SCID-X1的体细胞遗传挽救。
Hirschhorn等人首先在1例腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症患者中描述了逆转型SCID表型。对被称为“SCID-X1的非典型病例”(其中轻度免疫缺陷表型与IL2RG的有害突变相关)的研究已经揭示，一些病例的特征是仅在T细胞中突变的IL2RG序列逆转为野生型。这些T细胞大多数或全部具有记忆T细胞表型，并表现出某种程度上广泛的T细胞受体(TCR) Vβ库(即1% ~ 10%为对照记忆T细胞)。这些观察表明，体细胞挽救发生在TCRβ重排之前。如果我们假设拯救事件发生在单个细胞、HSPC甚至成血管细胞中，那么被拯救的T细胞前体一定已经广泛分裂，在TCRβ重排之前至少分裂了10或11次。
图1：严重联合免疫缺陷的免疫细胞分化缺陷
基因治疗的技术进展。
与此同时，用于生产逆转录病毒载体的技术也取得了一些进展，这些进展最初是基于鼠γ逆转录病毒(oncoretroviruses):(1)开发了包装细胞系，以生产更高滴度的载体;(2)使用细胞因子诱导HSPCs分裂;(3)使用纤维连接蛋白片段来增强HSPC-载体的相互作用。在大多数工程载体中，转基因cDNA被置于病毒长末端重复序列的增强子元件的转录调控之下。
SCID-X1的基因治疗。
基于本文前面所述的进展，作者设计了编码IL2RG cDNA的γ-逆转录病毒载体，并在体外试验中成功测试了该载体，研究发现该载体可使SCID-X1患者的HSPCs分化为T细胞和NK细胞，而且在体内γc缺陷小鼠模型中也可使HSPCs分化为T细胞和NK细胞。1999年，针对缺乏HLA匹配供者进行HSCT的SCID-X1患者开展了一项临床试验。未给予清髓治疗。10例患者在巴黎接受了治疗，另外10例在伦敦接受了类似的治疗方案，即用经过改造的逆转录病毒靶向来自患者自身骨髓的CD34+ HSPCs。
图2：SCID-X1基因治疗关键进展的时间线
ADA缺陷的基因治疗。
ADA酶缺乏导致其底物脱氧腺苷的积累。后者被转化为脱氧-ATP，后者也会累积并对淋巴祖细胞有毒，从而导致ADA SCID。这种SCID的典型特征是所有淋巴细胞亚群的缺失。鉴于ADA是一种普遍存在的酶，它的缺乏也会不同程度地影响肺、肝和脑的功能。与SCID-X1一样，ADA缺陷表型可通过体细胞遗传挽救部分逆转。ADA SCID也可通过异基因HSCT治愈，但尽管近期取得了进展，其结局通常比其他SCID更差。聚乙二醇化ADA的酶替代疗法也已开发并显示出一定的疗效。然而，它并不能提供令人满意的长期纠正免疫缺陷。
ADA缺乏症是首个以基因治疗为靶点的SCID。初始治疗包括再次注射从接受聚乙二醇化ADA治疗的患者获得的转导T细胞。这导致转导的CD8+ T细胞持续存在，但未纠正SCID。早期转导来自患者脐带血或骨髓的HSPCs的尝试失败了，因为该技术尚不合适。与SCID-X1基因疗法的开发过程一样，Aiuti等开发了一种基于γ-逆转录病毒的载体，该载体能够持续纠正T细胞免疫缺陷，这一点得到了Gaspar等的另一项研究的证实。
其他SCIDs的基因治疗。
SCID表型可由多种不同的基因型引起。一个亚群显示TCR和B细胞受体V(D)J重组的遗传缺陷，如在重组激活基因1蛋白(RAG1)或RAG2缺陷中观察到的。Artemis、DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA- pkcs)、DNA连接酶4和非同源末端连接因子1 (NHEJ1;也称为Cernunnos)都会损害V(D) J重组的非同源末端连接(NHEJ)修复步骤。RAG1缺乏症是本组最常见的疾病。除导致SCID表型的无效突变外，低形性突变的梯度导致了从Omenn综合征(一种以寡克隆扩增的辅助性T 2细胞浸润皮肤和其他组织为特征的疾病)到成人的联合免疫缺陷。这些疾病预后差，是基因治疗的潜在候选者。可能治愈的异基因HSCT是可行的，但仍受到供者-宿主免疫冲突风险的限制。
在这种情况下，基因疗法和HSCT面临的挑战是应对V(D)J重组的失败，后者会导致T细胞发育的相对晚期阻滞。胸腺内T细胞前体的存在是供体或转导的自体祖T细胞植入的潜在障碍。RAG1和RAG2在T细胞和B细胞发育的某些阶段有选择性地表达。
图3：SCID-X1基因治疗后的淋巴细胞生成
其他IEI的基因治疗。
考虑到SCIDs的基因疗法取得的积极结果，以及主要基于基于慢病毒载体的技术进步，人们在逻辑上尝试通过基因转移纠正其他形式的IEI，即使转导细胞的选择性优势较弱或缺乏。包括影响淋巴系统和/或髓系的疾病。
Wiskott–Aldrich综合征。
使用第一代γ-逆转录病毒载体进行基因治疗的早期尝试成功地消除了免疫缺陷，但通过几乎所有患者(n = 9)的LMO2或组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶MECOM基因(MECOM)致癌位点的反式激活，导致了载体诱导的白血病。与此同时，Aiuti等产生了一种自失活慢病毒载体，其中WASP cDNA被置于其内源性启动子的转录控制之下。该载体已用于三项临床研究。总体结果是积极的，因为基因治疗导致(1)持续纠正免疫缺陷，(2)在减轻相关并发症方面明显获益，(3)部分纠正血小板减少。该操作是安全的，没有克隆选择的迹象。3项研究共涉及36例患者的治疗，其中35例经过2 ~ 10年的随访仍存活。值得注意的是，即使是1例成人WAS患者也被成功治疗。血小板减少症的纠正水平是这种方法的限制因素;它似乎与转导的HSCs数量相关，通过检测转导的中性粒细胞的比例间接确定。对整合位点模式的研究表明，数千个HSPCs被转导，具有多种整合位点组合。有趣的是，这些结果表明，具有不同亚群分化能力的HSPCs(包括淋巴偏倚的祖细胞)确实被转导。总的来说，这些发现表明，在WAS的基因治疗成为相对于HSCT的治疗选择之前，必须提高转导效率，或许还必须提高转导细胞中的WASP表达水平。
基于基因组编辑的基因治疗。
治疗性基因组编辑是一个相对较新的概念，利用核酸内切酶通过引导蛋白或互补RNAs靶向DNA中的精确位置。第一个这样的技术是基于工程蛋白，其中一个特定的DNA结合域与核酸内切酶偶联，即锌指蛋白和转录激活因子样效应核酸酶。CRISPR DNA和CRISPR相关蛋白9 (Cas9)的结合提供了一项重大进展，因为DNA编辑可以在基因组的许多部分进行工程改造，并且向导RNAs易于制备。
SCIDs中基因组编辑的临床前结果。
最初的尝试是基于锌指核酸酶的使用。虽然提供了基因校正原理的证据，但这些事件在HSPCs中的发生频率低，可能低到无法产生临床获益。CRISPR-Cas9技术受到以下情况的限制:修复DNA断裂而不产生进一步突变(例如插入或缺失)所需的HDR机制在HSPCs等非周期细胞中表达低。将CRISPR-Cas9系统与含有DNA模板的6型腺相关病毒载体相结合可提高校正率，这一点在移植到免疫缺陷小鼠的经过编辑的人HSPCs的异种模型中得到了证明。正确编辑的比例上升到20%到45%之间。根据我们从基因相加疗法中了解到的情况，这种纠正程度可能足以产生临床疗效。该技术的一个问题是可能发生遗传毒性脱靶DNA重组事件，但我们目前的知识提示风险相当低。
图4：基因组编辑进展的时间表
基因失活。
几种IEI是由显性功能获得性突变或具有跨显性负效应的突变引起:例如引起自身免疫性增殖激活PI3Kδ综合征的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) p110突变、引起自身免疫性淋巴细胞增生综合征的STAT1功能获得性突变和一些引起自身免疫性淋巴细胞增生综合征的TNFRSF6(也称为FAS)突变。在单倍剂量不足无害的情况下，通过CRISPR-Cas9在突变等位基因中特异性引入缺口导致的基因失活可能导致等位基因丢失和正常功能恢复。如本文前面所讨论的，这种方法比突变修复容易得多，因为在这种情况下，由Cas9诱导的DNA断裂激活的NHEJ修复机制会产生想要的失活突变。难点在于如何在不影响野生型等位基因的情况下特异性地靶向突变等位基因。一项非常出色的研究表明，有可能使BCL11A的红系特异性增强子发生突变，从而重新激活β地中海贫血患者胎儿血红蛋白的持续表达。尽管基因的失活不是等位基因特异性的，但这项研究为这种方法提供了非常有力的原理证明。
结论和展望：
在过去25年中，我们已经看到了有效且现在安全的基因疗法，这些疗法为SCID-X1、ADA SCID以及WAS和CGD(尽管程度较轻)提供了持续的临床获益。许多科学和技术进步提高了这些方法的疗效和安全性。然而，该技术仍需优化以获得更广泛的应用。基因组编辑技术的出现，包括最近的碱基编辑和启动编辑，为IEI的治疗应用开辟了广阔的研究领域。然而，应该记住的是，“常规”HSCT也在进展，并导致更高的IEI治愈率。基因治疗的每一个新方面都必须与HSCT进行比较，特别是在基因治疗产品极其昂贵的经济背景下。校正细胞的标记是临床基因治疗的替代结果之一，可以精确、长期地研究HSCs通过各种淋巴细胞亚群在体内的群体动态。这些研究对理解造血和淋巴细胞生成的病理生理学具有重要价值。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41577-022-00800-6
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