化学剪刀： IEDDA cleavage reaction

前言

1927年，狄尔斯与阿尔德共同报道了发生在富电子双烯体和缺电子亲双烯体之间的[4+2]环加成反应, 即狄尔斯-阿尔德（DA）反应。从反应机理上看，DA反应十分有趣。正常电子需求DA反应的电子由双烯体的最高占据分子轨道（HOMO）向亲双烯体的最低占据分子轨道（LUMO）转移，而在逆电子需求DA（IEDDA）反应的电子转移方向则与之相反。根据氨基甲酸酯（连接臂）与烯烃距离远近不同，IEDDA的反应类型还可分为偶联反应与断键反应（图1）。此外，在对四嗪介导IEDDA反应的机理研究中，哈佛大学麻省总医院Ralph Weissleder课题组提出了“局部酸催化理论”，解释了双环分子间局部酸性对四嗪-反式环辛烯亲点击断键反应速率的影响[1]。

基于以上化学基础研究，IEDDA反应也因其生物兼容性好、反应速率快等特点，常被用作生命系统的探索工具。例如，研究人员通过对IEDDA偶联反应底物进行相应化学修饰，在四嗪底物上修饰报告基团或者定位基团，实现生物大分子成像；将IEDDA偶联反应与非天然氨基酸结合，实现对蛋白质功能调控。本篇文章将重点总结IEDDA断裂反应的应用，阐释IEDDA反应作为化学剪刀的优势。

图1：IEDDA偶联反应与断键反应

IEDDA断键工作流程

‍2013年，Robillard课题组首次利用IEDDA断键反应实现阿霉素的前药激活策略，这一点击释放反应目前已发展成为重要生物正交化学工具。以四嗪-反式环辛烯为底物基础，IEDDA断键反应作为化学探针的工作流程通常为利用反式环辛烯对目标分子进行保护修饰，随后加入四嗪实现对目标分子的活性调控。研究人员以此为基本思路，加以不同的创新想法，开发了许多应用策略。接下来将以实例展示IEDDA断键反应解决生物学问题的应用潜力。

1.生物正交脱笼反应：蛋白质功能激活

2014年，北京大学陈鹏课题组将IEDDA断键反应底物TCO设计为非天然氨基酸，通过遗传密码拓展技术引入萤火虫荧光素酶中。由TCO修饰的荧光素酶无法激活荧光素的荧光状态，当加入四嗪底物时，荧光素酶上赖氨酸的TCO保护基与四嗪发生IEDDA断键反应，荧光素酶功能被原位激活，并且能够重新激活荧光素的高强度荧光状态。这项工作首次利用IEDDA断键反应用于蛋白质功能的原位激活，推动了生物正交剪切反应的发展[2]。

2016年，该课题组将由IEDDA断键反应开发生物正交剪切策略应用于活细胞中的激酶调控。通过对活细胞中的MEK1蛋白、FAK蛋白、Src蛋白的关键位点赖氨酸添加TCO保护基团，关闭蛋白激酶活性，再额外加入四嗪底物，实现激酶活性原为激活。随后，还将这一策略应用于拓展到活动物中[3]。这项工作展现了IEDDA断键反应在激酶活性调控中的优势，该策略能够在细胞环境中以较小信号扰动、低毒的优势探索细胞信号通路。

2022年，陈鹏课题组对IEDDA断键反应再次创新应用，开发了生物正交的碱基编辑器（BaseBAC）策略[4]。这项工作通过在nCas9与PAM序列结合的界面上插入TCO修饰的非天然氨基酸，阻断nCas9与核酸的结合。随后，借助外源四嗪分子的剪切作用，恢复nCas9蛋白的实现原位启动特异性细胞焦亡。这一策略通过插入非天然氨基酸抑制靶蛋白活性，利用IEDDA断键反应的化学特点实现对细胞过程特异性调控。

2.IEDDA化学剪刀分子探针

在完成IEDDA断键反应机理研究工作（提出了“局部酸催化理论”）后，哈佛大学麻省总医院（Massachusetts General Hospital）Ralph Weissleder课题组的Jonathan C. T. Carlson博士在此理论基础上，重新设计并合成了新型的C2对称反式环辛烯的生物正交IEDDA断键反应，这一策略相比于以往的生物正交断键策略，可实现更快速、更完全的化学切割[5]。

2022年，Jonathan C. T. Carlson 博士将IEDDA断键反应与荧光猝灭剂BHQ3-荧光染料Alexa相互作用对结合设计了活细胞的化学成像的SAFE策略。在这一策略中，作者利用Alexa-C2TCO标记抗体实现活细胞成像，随后加入荧光猝灭剂BHQ3-四嗪外源分子。在BHQ3- Alexa相互作用的帮助下，C2TCO与四嗪之间的化学反应速率进一步提高，可实现快速、彻底的细胞荧光擦除。利用该策略，在小鼠的肝脏切片与造血干细胞实现了体外对生物标志物的时间相关的动态成像，也证明了SAFE策略能够高效实现活细胞生理过程的动态成像。

大多数文章可去北京大学陈鹏课题组主页阅读

Unraveling Tetrazine-Triggered Bioorthogonal Elimination Enables Chemical Tools for Ultrafast Release and Universal Cleavage J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 10, 3603–3612

转自：“国家纳米科学中心”微信公众号

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