以下文章来源于北京生物结构前沿研究中心 ，作者肖媛
转录起始是由DNA依赖的RNA聚合酶 (RNA polymerase, RNAP) 催化的一个多步骤过程。转录起始的基本步骤在所有生命领域中都是保守的；然而，由于从噬菌体到人类的转录机制的复杂性不断增加，转录起始的确切机制可能在不同系统中有所变化1。最初的RNA合成通过保守的DNA卷曲机制进行2，这使得RNA-DNA和转录泡在聚合酶裂缝的有限空间中扩展。在早期转录起始步骤中，应激的起始复合物 (initiation complex, IC) 中间体触发通路外回溯和RNA合成终止3。然而，在合成8-到12-核苷酸RNA后，应激的IC发生构象变化，转变为稳定的延伸复合物 (elongation complex, EC)。动态的IC中间体在结构和生物化学上具有挑战性。因此，从转录泡打开到EC转变的这种状态尚未被系统地可视化。
线粒体RNAP (mtRNAP) 对于真核生物中线粒体DNA的转录和复制是必不可少的。mtRNAP与噬菌体T7 RNAP密切相关。酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) mtRNAP (y-mtRNAP; Rpo41) 在结构和功能上与人类mtRNAP (h-mtRNAP; POLRMT) 具有相似性。y-mtRNAP需要一个转录因子Mtf1，而h-mtRNAP需要两个转录因子TFAM和TFB2M；T7 RNAP不需要任何转录因子。
2023年10月11日，比利时鲁汶大学Kalyan Das实验室与美国罗格斯大学Smita S. Patel实验室合作，在Nature期刊上发表了题为Structures illustrate step-by-step mitochondrial transcription initiation的论文。研究者解析了y-mtRNAP-Mtf1转录复合物高分辨冷冻电镜结构，每个结构都有完全解析的转录泡和RNA-DNA杂交体。从PmIC到IC8的结构可视化了从启动子打开到EC转变的整个转录起始过程，提供了一个全面的、逐步的转录起始机制。
视频 1 从PmIC到IC8和EC每增加一个核苷酸后转录泡的结构变化
研究者将y-mtRNAP (∆N100)，Mtf1和特定的DNA启动子混合，并通过催化适当NTPs的加入，以生成PmIC、IC2-IC8状态。最后，研究者成功解析了IC2，IC4，IC5，IC6，IC7和IC8的冷冻电镜结构，分辨率分别在3.47，3.44，3.39，3.62，3.75和3.62 Å。研究者使用h-mtRNAP EC晶体结构模拟了IC8到EC的转变，并将这九种结构状态连续成视频，展示了转录起始和转变为延伸的动态过程（视频1和2）。
视频 2 从PmIC到IC8和EC每增加一个核苷酸后y-mtRNAP和Mtf1的结构变化
图 1 y-mtRNAP在单核苷酸添加步骤中从PmIC到IC8的转录起始过程
y-mtRNAP具有一个右手形状的羧基末端聚合酶结构域，包括掌状区域 (Plam)、指状区域 (fingers) 和拇指状区域 (thumb)，这些亚区域在所有单亚单位RNAP中都存在（图1a、1b）。这些亚区域包围了聚合酶裂缝，其中包含RNA合成的活性位点以及容纳转录泡和RNA-DNA双链的空间（图1c）。Mtf1位于聚合酶裂缝的顶部，像一个盖子（图1a）。转录泡区域的非模板链主要与Mtf1相互作用，而模板链主要与y-mtRNAP相互作用。
IC2在转录起始位点捕获了两个结合的GTP分子，准备进行催化（图2a）。在转录起始时，失败途径是转录起始的离轨事件，在所有细胞RNAP中发生。其中，y-mtRNAP-Mtf1主要产生2-和3-核苷酸的RNA中止产物。从IC2开始，y-mtRNAP裂缝中的模板DNA采用U形结构（图2c）。随着RNA-DNA杂合链从IC2到IC3到IC4的增长，从-4到-1的模板核苷酸逐渐卷曲。值得注意的是，非模板链 (non-template, NT) 在IC2和IC3中卷曲成紧密的环状，而在IC4中放松（图2d）。由于短RNA与y-mtRNAP和模板链的相互作用较少，使IC2和IC3状态较不稳定，增加了解离这些短RNA并返回PmIC的概率（图2b）。IC4中的NT链承载的应力较小，更有利于RNA延伸而非中止合成。值得注意的是，IC4中的4bp RNA-DNA双链处于半位移状态，即新生RNA的3'端从N位点的C1'位置移动约3.5 Å，但尚未到达P位点（图2e）。
图 2 IC2到IC4的结构揭示了转录起始失败的结构基础
为了验证NT链的卷曲和解卷曲是否导致2个和3个核苷酸RNA的中止合成，研究者引入了切口和核苷酸缺失以破坏NT环的形成，结果表明，切口和核苷酸缺失的NT导致转录中止产物显著减少（图2f、2g），表明NT卷曲导致转录起始失败。
图 3 IC4到IC5过渡中的结构重排
IC5中的5bp RNA-DNA双链处于半位移状态，RNA的3' 端位于N位点（图3a、3b）。在IC4到IC5的转变中，Mtf1的C端和NT链发生了重大变化。在IC2-IC4状态下，C端位于RNA-DNA双链和thumb域之间，并且C端参与模板对齐和DNA卷曲。在IC5中，5bp RNA-DNA将Mtf1的C端推到转录泡的中心新位置（图3c）。同时，NT链从IC4的聚合酶裂隙中心向Mtf1的N端移动约15Å到达IC5。重新定位的NT链形成了一种独特的堆积结构，类似于螺旋楼梯，其中+1到+6的核苷酸可以通过冷冻电镜密度图清晰地辨认出来（图3d）。
图 4 IC7到IC8过渡中的关键结构重排
研究者优化了启动子序列，成功地产生了IC7和IC8状态的结构。IC8显示了与IC7中的DNA和蛋白质的主要结构重排，这可能与8个核苷酸的RNA合成的IC至EC转变有关。直到IC7状态，Thumb域与Mtf1的相互作用都有助于稳定IC状态，值得注意的是，这种相互作用在IC8中丢失了（图4a、4b）。阶梯样NT链将Mtf1向一个方向推动约12 Å，而卷曲的模板链将thumb域向相反方向推动约7 Å（图4c），从而触发了Mtf1-thumb相互作用的解离。RNA 3'端在IC8中占据P位点，在IC7中占据N位点；因此，RNA-DNA的5'端延伸了2个核苷酸长度，约10 Å（图4d），并将模板和Mtf1的C尾推到IC8中的新位置。IC8中RNA的5'端占据了IC7中Mtf1的C尾的空间，而C尾被推出聚合酶裂隙（图4e）；在IC8中D330之后的C尾是无序的。IC8中的8个核苷酸RNA-DNA也将单链模板推向高度卷曲状态（图4f）。IC8中的严重卷曲模板将y-mtRNAP N端的519-528区域重新定位约8 Å（图4g），从而引发了一系列的结构重排，包括Mtf1 hairpin和intercalating hairpin分别从IC7中的位置移动约15 Å和约5 Å。因此，与IC7相比，Mtf1 hairpin和thumb之间的间隙在IC8中延长了约18 Å（图4a-c）。Mtf1 hairpin与Mtf1的C端结构域相互作用，intercalating hairpin稳定了转录泡。thumb、Mtf1 hairpin和intercalating hairpin必须从 Mtf1中解离，以释放上游启动。
在每个核苷酸添加过程中，RNAP的活性位点在多个构象状态之间循环，允许NTP结合、催化插入和转位，其中在单亚基RNAPs中，O和Y螺旋参与活性位点的作用。y-mtRNAP的IC状态被捕获在活性位点的不同构象状态中（图5a）。T7 RNAP、h-mtRNAP和y-mtRNAP的IC结构中存在RNA-DNA和下游DNA双链之间的模板扭曲。值得注意的是，IC8中的这个区域被拉伸（图5b），然后在h-mtRNAP的EC结构中恢复到典型的模板扭曲。IC8中的RNA 3'末端位于P位点，但+9模板碱基尚未移动到N位点。IC8中异常拉伸的模板链显然捕获了一个转位的瞬态状态，因为结构中使用的转录泡未能使上游DNA退火，从而导致IC8停滞在下一个模板核苷酸转位到N位点之前的过渡状态。
图 5 活性位点的结构变化和从IC8到EC的转变
单亚基RNAPs的先前研究比较了EC与早期IC状态的结构，以推断伴随IC到EC转换的构象变化。在该项研究的中间结构状态中，到达IC8的IC到EC转换点，研究者可视化了转录泡破裂和Mtf1释放所需的具体构象变化。IC8结构（图4）展示了NT链如何推动Mtf1和高度皱缩的模板链。为了理解IC8到EC转换的最后几步，研究者将y-mtRNAP IC8与h-mtRNAP EC的RNAP进行了比对（图5c、5d）。结果显示，IC8和EC结构中的下游DNA和RNA-DNA轨迹一致，表明这些元素在转换中保持相对不受影响。然而，上游DNA经历了大约120°的旋转运动，从IC8中严重弯曲的结构到EC中的松弛构象。IC8中模板链与EC中RNA的5'末端之间的潜在冲突可能有助于模板的重新组织（图5e）。值得注意的是，y-mtRNAP（或h-mtRNAP）的Mtf1 hairpin（或 lever loop/B2 hairpin），支持Mtf1（或TFB2M）的C端域在IC状态下与上游DNA相连，在EC状态下与上游DNA相连（图5f）。
总的来说，研究者通过解析酵母线粒体RNAP的高分辨率低温电镜结构和转录因子Mtf1在单核苷酸添加步骤催化2至8核苷酸RNA合成，提供了一个全面的，逐步的转录起始机制。RNA-DNA杂合链通过模板链挤压和非模板链重组被容纳在聚合酶间隙中，产生应激中间体。在起始早期，非模板链的卷曲和解卷曲会破坏短的二核苷酸和三核苷酸RNA的稳定性，从而引发转录终止。随后，非模板链重组成一个基础堆叠的阶梯状结构，支持5到8个核苷酸的RNA合成。IC8中扩展的非模板链阶梯和高度皱缩的模板链破坏了启动子与Mtf1相互作用的稳定性，从而促进了转录泡的破裂和启动子逃逸，从而实现了从启动到延伸复合物的过渡。一系列转录起始步骤，每个步骤都由多个结构组分的相互作用指导，揭示了潜在调控的精细调节机制。这些见解将增强我们对人类系统中线粒体DNA转录起始机制的理解。
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https://www.nature.com/articles/s41586
-023-06643-y
转自：“水木未来资讯”微信公众号
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