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导读
枸杞(Lycium barbarum L.)是一种典型的中草药和食用植物，目前在全球范围内被广泛食用。低分子量枸杞低聚糖(LBO)在体外抗氧化活性和胃肠道消化率方面优于高分子量多糖。然而，LBO对肝脏疾病的治疗作用尚未见研究。通过LBO调节肠道微生态是一种很有前景的治疗肝纤维化的方法。本文制备了LBO并对其进行了表征。CCl4处理的小鼠经口灌胃LBO，根据相关指标(肠道菌群、粪便代谢物和生理生化指标)评估LBO对肝纤维化和线粒体异常的影响。结果表明，LBO是一种具有α-糖苷键和β-糖苷键的吡喃糖环低聚糖，是一种潜在的益生元。此外，补充LBO恢复了细菌群落的结构，增强了胃肠道中有益微生物物种的增殖(如Bacillus、Tyzzerella、Fournierella和Coriobacteriaceae UCG-002)，改善了微生物代谢的改变(碳水化合物代谢、维生素代谢和肠-肝循环)，并增加了抗氧化物含量。最后，LBO给药降低了血清炎症细胞因子和肝脏羟脯氨酸水平，改善了肠道和肝脏线粒体功能，并改善了小鼠肝纤维化。上述结果表明，LBO可以作为一种益生元，并具有显著减轻肝纤维化的能力。
论文ID
原名：Microbial modifications with Lycium barbarum L. oligosaccharides decrease hepatic fibrosis and mitochondrial abnormalities in mice
译名：枸杞低聚糖的微生物修饰可减少小鼠肝纤维化和线粒体异常
期刊：Phytomedicine
IF：7.9
发表时间：2023.9
通讯作者：崔波，陈晓
通讯作者单位：齐鲁工业大学(山东省科学院)；山东中医药大学健康学院
DOI号：10.1016/j.phymed.2023.155068
实验设计
结果
1.LBO的化学和生物学特性
HPGPC分析结果显示，在23.325处有一个显著峰，LBO的分子量为775.42 Da(图1A)。LBO的FTIR光谱显示出低聚糖的特征峰(图1B)。在3342 cm-1附近的宽峰是C=O基团中O-H、N-H和C-H键的伸缩振动，2927 cm-1附近的宽峰是-CH3/-CH2-基团的伸缩振动。1635 cm-1处的峰是C=O键的伸缩振动。1414、1079和1024 cm-1处的峰是C-H的弯曲振动。847 cm-1和763 cm-1处的峰分别归属于甘露糖环和α-D-吡喃葡萄糖环。这些结果证实LBO是一种具有α-糖苷键和β-糖苷键的吡喃糖环低聚糖。此外，在LBO的XRD曲线上，在20°左右，一个平坦而宽的“芋头”峰完全消失(图1C)，这是由于酸和酶破坏了植物多糖的非共价键、晶体结构和无定形区。这说明LBO是一种典型的非晶体物质。IC结果表明，LBO由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和海藻糖组成(图1D和E)。通过扫描电镜观察了LBO的微观结构特征，发现LBO大小不均匀，表面粗糙，有规则或不规则的球形结构(图1F)。
为了证实LBO是益生元的潜在来源，作者评估了体外模拟消化过程中LBO水解的变化水平。结果显示，在模拟胃肠道环境中，LBO的消化最少(图1G)。为了进一步研究LBO对益生菌增殖的影响，采用不同浓度的LBO对L. rhamnosus ATCC 7469和B. longum XY01进行24 h发酵。结果表明，添加LBO显著提高了这两种益生菌的体外生长，其效果与低聚果糖相似(图1H和图1I；P > 0.05)。这与之前的研究结果一致。由此可见，LBO是一种不可消化的低聚糖，可作为益生元调节肠道菌群。
图1. LBO的化学和生物学特性。(A) HPGPC法测定LBO分子量；(B) LBO的傅里叶变换红外光谱图；(C) LBO晶体结构的x射线衍射图；(D)标准单糖离子色谱法；(E) LBO离子色谱法。Man:甘露糖；Rib：核糖；Rha：鼠李糖；D-GalA：D-galactose；GlcA：葡萄糖醛酸；Glc：葡萄糖；Gal：半乳糖；Xyl：木糖；Ara：阿拉伯糖；Fuc：海藻糖；(F) LBO的SEM图像。(G)体外模拟消化过程中LBO水解程度的变化。(H)分别由L. rhamnosus ATCC 7469和(I) B. longum XY01发酵低聚果糖(FOS)和LBO 24 h后的最终OD600。
2.LBO减轻小鼠肝脏线粒体异常和纤维化
治疗8周后，通过检测血清ALP、AST、ALT和HYP水平，肝组织MDA和HYP含量(表1)，肝组织病理染色(图2A)，评估LBO对小鼠肝纤维化的影响。与CON和LBO处理小鼠相比，MOD组小鼠血清ALP、AST、ALT、HYP和促炎细胞因子(TNF-β和IL-17a)含量显著升高(P < < 0.05)，肝脏MDA和HYP水平显著升高(P < < 0.05)。脂质代谢紊乱是慢性肝病的典型特征。在本研究中，MOD组血清TC和TG水平明显降低(表1)。同时，肝脏组织内脂质过度积累，肝脏TC和TG含量显著升高，表明MOD组动物脂质代谢明显紊乱。此外，组织学染色显示模型小鼠肝纤维化明显，微观和宏观脂肪变性明显，CON组和LBO组可见典型的肝脏结构，细胞核位于细胞中间，未见细胞凋亡，肝细胞呈均匀分布的条索状排列(图2A和B)。这些结果表明，LBO减轻了CCl4处理的肝纤维化小鼠的肝损伤。此外，CON组、MOD组和LBO组小鼠的体重和肝/身体质量比均无统计学差异(表1；P > > 0.05)。
先前的研究表明，在CCl4处理的小鼠中，肝纤维化与肝脏ROS生成和线粒体功能障碍有关。为了进一步探索LBO改善小鼠肝纤维化的机制，本研究评估了肝细胞线粒体损伤，重点关注线粒体H2O2释放(图2C)、线粒体完整性(图2D)、ROS产生(图2E)、线粒体膜电位(图2F)和线粒体分裂/融合蛋白mRNA水平(图2G-I)。与CON组和LBO组相比，MOD组线粒体H2O2释放率显著升高，而LBO组线粒体H2O2积累量较CON组显著增加(P < < 0.05，图2C)。CON和LBO组肝细胞线粒体超微结构具有典型体积，具有完整的折叠内膜和富含嵴的致密基质(红色箭头)，而MOD组肝细胞线粒体膜受损，部分嵴无法观察到(图2D)。此外，使用共聚焦显微镜检测DAPI染色的核酸和MitoTracker Red染色的线粒体，分别显示蓝色和红色荧光(图2E)。结果显示，与CON组和LBO组相比，MOD组线粒体ROS显著增强。线粒体代谢功能由鸟苷三磷酸酶家族(如Mfn1、Drp1和Fis1)主导，线粒体膜电位对线粒体功能和细胞活性至关重要。Mfn1是存在于线粒体外膜上的一种线粒体融合蛋白，而Drp1和Fis1具有增强线粒体分裂的功能。在本研究中，与CON组和LBO组相比，MOD组Mfn1蛋白表达水平和线粒体膜电位降低，Drp1和Fis1蛋白表达水平升高(图2F-I)。综上，这些结果表明，LBO治疗可显著改善小鼠肝纤维化和线粒体功能障碍。
表1 三组小鼠体重及血清、肝脏临床生物标志物水平。
图2.补充LBO可减少小鼠肝纤维化和线粒体异常。(A) H&E(200倍放大)和Masson染色的代表性肝脏切片；(B)不同组Masson染色肝脏切片胶原面积百分比；(C)肝脏组织线粒体H2O2释放；(D) TEM显微镜图像(3000倍放大)显示具有代表性的肝细胞线粒体超微结构。红色箭头表示肝细胞中可见的嵴；(E)肝细胞用MitoTracker Red染色，共聚焦显微镜(比例尺:20 μm)检测。(F)各组小鼠肝脏线粒体膜电位分析。肝脏组织Mfn1 mRNA (G)、Drp1 mRNA (H)和Fis1 mRNA (I)水平分别标准化为CON组水平。
3.LBO改变了小鼠肠道细菌群落
总共从小鼠粪便样本中获得了68,855个有效序列。基于≥97%的序列同源性，对所有合格OTU的有效reads进行聚类。弦图(图3A)显示了这三组中数量最多的前10个门：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、Epsilonbacteraeota、放线菌门、Patescibacteria、Deferribacteres、Tenericutes、蓝细菌门和疣微菌门。MEGAN树(图3B)显示了前10个属的相对丰度，Alloprevotella、Coriobacteriaceae_UCG_002和Ruminococcaceae_UCG_014分别是CON、MOD和LBO组的优势属，占总OTUs的10.10% ~ 62.50%。为了鉴定各组细菌生物标志物，通过LEfSe分析评估CON组、MOD组和LBO组粪便微生物组的差异(图3C)。在属水平上，CON组优势属为Corynebacterium_1、Phoenicibacter、Porphyromonas、Sediminibacterium、Staphylococcusin、Granulicatella；MOD组优势属为Brevibacterium、Collinsella、Eggerthella、Petrimonas、Paraprevotella、Sphingobacterium、Hymenobacter、Gemella、Enterococcus、Streptococcus、Anaerostipes、Faecalibacterium和Ruminiclostridium。LBO组优势属为Parvibacter、Alloprevotella、Bacillus、Lactobacillus、Butyrivibrio、Eisenbergiella、Tyzzerella、Desulfosporosinus、Fournierella。通过主坐标分析(PCoA)表明了LBO对肠道微生物组的影响。结果显示(图3D)，三组的细菌群落结构存在相当大的分离，表明LBO给药诱导了肝纤维化小鼠肠道微生物组的结构改变。PC1、PC2和PC3的总变异解释率为72.59%，表明分离是稳定可靠的。然而，LBO组的细菌组成与CON组不同，这表明LBO干预并没有使肝纤维化小鼠的肠道群落恢复到健康水平。综上所述，CON、MOD和LBO组的细菌群落组成存在显著差异。
图3. CON组、MOD组和LBO组肠道菌群组成。(A)弦图显示了三组细菌群落的前10个门；(B)三组细菌群落前10个属的MEGAN分析。MEGAN树的每个圆圈表示NCBI分类中的一个分类单元，并通过其名称和对该分类单元有贡献的reads数来标记。扇区面积的大小表示分类的相对丰度；(C) LEfSe分析确定了三组细菌群落中差异最大的分类群；(D)粪便细菌群落主坐标分析(PCoA)。
4.LBO改变了小鼠粪便代谢物谱
细菌群落与宿主-微生物组代谢有关，检测粪便代谢物被认为是探索细菌群落与宿主表型之间相互作用的有价值的方法。用UPLC-MS/MS在正负离子模式下共观察到2605个峰。根据粪便代谢物的三维坐标计算并绘制主成分评分图(图4C)。PC1、PC2和PC3分别解释了总方差的29.89%、15.06%和9.69%，说明模型稳定可靠。OPLS-DA模型表明，MOD组和LBO组的粪便代谢组存在明显差异(图4A)。火山图(图4B)中每个点表示一种粪便代谢物，红色、蓝色和灰色点分别表示代谢物上调、下调和不变(P> > 0.05)。根据变量投影重要性(> 1.0)和倍数变化值(FC > 2.0)，选择36种代谢物作为潜在的生物标志物。这些代谢物与9个不同的簇有关。利用聚类热图鉴定了47种粪便代谢物(P < < 0.05；图4D)。LBO给药小鼠的粪便中共有39种代谢物的含量显著增加，包括对-乳-N-六糖、吡哆醛、二氢麦角胺、叶酸和苯乳酸，而8种粪便代谢物的含量显著降低，如Glycohyocholic acid、邻苯二甲酸二辛酯和茄碱。然后，通过KEGG数据库的代谢途径确定了MOD组和LBO组之间存在差异的关键代谢物。LBO干预显著改变了四种重要的代谢途径，包括内分泌抵抗、前列腺癌、类固醇激素生物合成和胆汁分泌途径(图4E)。
采用Pearson相关分析探究代表性菌群与粪便代谢物之间的相关性。相关矩阵热图(图4F)描述了已鉴定的微生物物种与代谢谱之间的正相关和负相关。MOD组的细菌生物标志物(图4F)，包括Anaerostipes、Anaerotruncus、Collinsella、Eggerthella、Sphingobacterium和Streptococcus与邻苯二甲酸二辛酯显示出很强的正相关性。这些微生物与对-乳-N-六糖、芹菜苷、肉豆蔻酰左旋肉碱和二氢麦角胺均呈负相关。LBO处理小鼠体内的细菌生物标志物(图4F)，包括Bacillus、Coriobacteriaceae UCG-002和Fournierella与对-乳-N-六糖、芹菜苷、吡哆醛、肉豆蔻酰左旋肉碱、Microcolin B、醋丁洛尔、叶酸、毛果天芥菜碱、二氢麦角胺和多虑平显示出很强的正相关。这三个物种与邻苯二甲酸二辛酯也呈负相关。综上所述，这些结果表明，LBO给药重塑了细菌群落，同时影响了肝纤维化小鼠的粪便代谢组。
图4. CON、MOD和LBO组粪便代谢谱分析。(A) MOD组和LBO组在正、负离子模式下的OPLS-DA评分图；(B)火山图显示MOD组和LBO组在正离子和负离子模式下的的变量差异。每个点表示一种代谢物。灰点表示无统计学差异，红点表示上调，蓝点表示下调；(C)各组PCoA评分散点图；(D)三组间差异丰富的47种代谢物归一化值的热图(P < 0.05)；(E)与LBO组相比，MOD组的KEGG通路富集；(F)与LBO组相比，MOD组11种细菌属(P< 0.05)和12种粪便代谢物(P< 0.01)之间的相关性。黄色和绿色分别表示正相关和负相关。
5.肠道功能及组织形态学特征
比较各组小鼠结肠上皮通透性和小肠吸收功能。通过检测血清DAO和D-LA水平，探讨LBO给药对肝纤维化小鼠结肠上皮通透性的影响。与MOD组相比，CON组小鼠血清DAO和D-LA水平显著降低(P < < 0.05)，反映了肝纤维化小鼠结肠屏障功能的增强(图5B和5C)。同时，与MOD组相比，LBO组的DAO和D-LA水平显著降低，表明LBO给药后肠道通透性降低(图5B、C)。此外，MOD组结肠内容物pH值(8.37±0.73)高于CON组(7.63±0.53)和LBO组(7.53±0.64)(P < < 0.05)，CON组与LBO组之间pH值差异无统计学意义(P> > 0.05；图5E)。CON组小鼠结肠切片可见典型的粘膜、粘膜下层、固有肌层和浆膜的微观结构和层边界。同时，粘膜腺富含黏液细胞，可见杯状细胞结构，具有典型的肠壁厚度(图5A)。而MOD组粘膜下层水肿，间隙增大(蓝色箭头)，粘膜腺内可见炎性细胞浸润(黄色箭头；图5A)。LBO处理小鼠结肠粘膜下层出现轻微水肿(蓝色箭头；图5A)。
绒毛长度(V)和隐窝深度(C)是小肠生长和营养吸收的重要指标，V/C比值反映了小肠的功能状态：V/C比值的降低表明存在粘膜损伤，营养吸收减少。与CON组和LBO组相比，MOD组的V/C比值显著降低(P < 0.05)，而CON、MOD和LBO组的绒毛长度、隐窝深度和V/C比值无显著差异(P > 0.05；图5F)。结果表明，肝纤维化小鼠存在小肠功能障碍，而LBO给药可改善小鼠小肠吸收功能。CON组小肠粘膜下层、粘膜层、肌层和浆膜层显示出标准的特征和边界(图5B)。然而，在MOD组和LBO组的小肠中均检测到炎症细胞浸润(黄色箭头)和脱落绒毛组织(红色箭头；图5B)。
图5. CON组、MOD组和LBO组的肠道功能和组织形态学特征。(A)结肠显微照片(放大200倍)。黄色箭头表示炎症细胞浸润；蓝色箭头表示粘膜下层水肿；(B)小肠显微照片(放大200倍)。黄色箭头和绿色箭头分别代表炎症细胞浸润和坏死的局部肌层；(C)血清DAO和(D) D-LA水平作为小鼠结肠屏障功能的指标；(E)结肠内容物的pH值；(F)反映小肠吸收功能的绒毛长度(V, mm)、隐窝深度(C, mm)和V/C比值。
讨论
植物源性低聚糖在营养和保健领域受到越来越多的关注。先前有研究报道了大豆低聚糖对妊娠期糖尿病孕妇的抗氧化酶活性和胰岛素敏感性有有益的影响。Yan等人报道称，大蒜(Allium sativum)寡糖表现出很强的抗氧化能力，在体外调节血清糖代谢调节，减少炎症反应。最近，Pansai等人证实火龙果低聚糖具有益生元活性，可以改变健康成人的细菌群落和粪便代谢物。本研究表明，LBO是促进益生菌体外增殖的潜在益生元(图1H和图1I)。有趣的是，作者之前的研究表明，LBO通过改善肝细胞形态，减轻肝脏脂肪变性和炎症反应，对肝功能具有保护作用。然而，LBO对肝纤维化的影响及其潜在机制尚不清楚。
线粒体功能障碍已在肝纤维化个体和动物模型中得到证实。它不仅引起组织学坏死性炎症，还会诱导肝脏内ROS积累，导致细胞因子过量产生和肝细胞凋亡。Yuan等人证实肠道细菌代谢物影响线粒体功能，诱导小鼠肝脏脂质积累和纤维化。鉴于线粒体功能与细菌群落之间的密切联系，对细菌群落进行修饰是治疗肝纤维化的一种潜在方法。这在全球慢性肝损伤发病率和死亡率不断上升的背景下具有重要意义。在当前研究中，给药LBO改善了线粒体功能，减少了ROS积累(图2C-I)，从而减少了小鼠肝脏脂肪变性和纤维化(表1和图2A)。对粪便微生物和代谢物的探索为这些现象背后的分子机制提供了更全面的视角。
LBO通过改变肠道微生物组和粪便代谢组改善肝脏线粒体功能和脂肪变性。CON组和MOD组之间的细菌群落结构和代谢物存在显著差异(图3和4)。有趣的是，本研究结果显示，与CON组相比，产生短链脂肪酸(SCFA)的物种，如Butyricicoccus和Blautia的丰度在MOD组显著升高(图3C)。这一结果似乎与已知的益生菌富集在这些属相反。相应地，在帕金森病、单核增生李斯特菌感染和乳腺癌患者的粪便样本中检测到Butyricicoccus和/或Blautia等共生细菌的富集。因此，本研究提示，在这些疾病患者中应谨慎使用这些益生菌(如Butyricicoccus和Blautia)。先前的研究表明，Anaerotruncus和Collinsella分别在肝纤维化和肝脂肪变性患者中显著增加。此外，Anaerostipes、Collinsella、Eggerthella、Sphingobacterium和Streptococcus被认为是糖尿病、炎症性肠病和肠易激综合征患者的潜在致病菌和生物标志物。此外，服用药理学植物(特别是穿心莲多糖和茯苓多糖)后肠道内Fournierella和Coriobacteriaceae UCG-002的丰度增加，二者被认为是改善体内免疫状态和减轻慢性非细菌性前列腺炎的有益菌。与之前的研究一致，本研究的结果显示，与LBO组相比，肝纤维化小鼠中上述七种潜在致病菌的丰度显著增加，而两种有益菌(Fournierella和Coriobacteriaceae UCG-002)的丰度显著降低(图C)。先前的研究已经证实，Bacillus和Tyzzerella分别与肠道中有益的SCFAs和芳香胺的产生有关。重要的是，LBO治疗逆转了肠道生态失调，增加了有益菌的丰度，包括Bacillus、Tyzzerella、Fournierella和Corobacteriaceae UCG-002，进一步改变了小鼠的粪便代谢组。
微生物组与粪便代谢组的相关结果显示，共生菌Bacillus、Coriobacteriaceae UCG-002和Fournierella与对-乳-N-六糖、芹菜苷、吡哆醛、叶酸、二氢麦角胺和多虑平呈正相关，而这三个属与邻苯二甲酸二辛酯呈负相关(图4F)。芹菜苷(apigenin-7-O-apiosylglucoside)是一种具有非诱变和无毒作用的类黄酮，已被证实在体内具有抗炎特性，它可以降低iNOS酶的表达。对-乳-N-六糖是一种与人乳相同的牛奶低聚糖，可以塑造细菌群落，促进免疫系统的发育，预防坏死性小肠结肠炎。吡哆醛，也被称为维生素B6，可以改善慢性肝病的炎症反应、肝细胞水肿和变性。此外，叶酸在预防非酒精性脂肪性肝炎的炎症和纤维化方面具有治疗潜力。然而，邻苯二甲酸二辛酯处理可提高肝脏MDA和超氧化物歧化酶水平，从而诱导小鼠肝损伤。简而言之，这些结果表明，通过增加共生益生菌(如Bacillus)，LBO增加了有益代谢物(如吡哆醛)，减少了有毒代谢物(如邻苯二甲酸二辛酯)。此外，越来越多的证据表明，与内分泌抵抗、类固醇激素生物合成和胆汁分泌途径相关的蛋白质参与肠道菌群失调和/或肝脏疾病，本研究中LBO处理后，这些途径中的代谢物增加(图4E)。
肝纤维化与血清中肝酶活性(如AST、ALT和ALP)、肝脏中HYP含量和炎症细胞因子(如TNF-β和IL-17a)的增强有关。在本研究中，与CON组相比，MOD组血清AST、ALT、ALP、IL-17a、TNF-β水平和肝脏HYP含量显著升高，而LBO组这些指标的水平显著降低(表1)。LBO已被证实对2型糖尿病和肝脂肪变性小鼠具有肝保护和抗炎活性，这与本文的结果一致。此外，与MOD组相比，LBO处理改善了结肠上皮通透性和小肠吸收(图5C、5D和5F)，降低了结肠内容物的pH值(图5E)，并维持了LBO组小鼠健康的肠道微环境。Zhang等人报道抗性糊精和枸杞多糖等植物源性益生元可降低小鼠结肠上皮通透性和pH值，增加小肠功能，进一步增强组织形态学特征。益生元对结肠和小肠形态和功能的有益作用机制与细菌群落的组成有关，并可能与细菌代谢谱有关。总之，这些积极影响对宿主的肝纤维化和线粒体功能障碍有有益的影响。
结论
本研究对酸酶法制备的LBO的化学和生物学特性进行了表征，并对LBO对小鼠肝纤维化和线粒体异常的影响及机制进行了阐述。结果表明，LBO是一种具有α-糖苷键和β-糖苷键的吡喃糖环低聚糖，在模拟胃肠道环境下难以消化，但能显著促进体外益生菌菌株(特别是L. rhamnosus ATCC 7469和B. longum XY01)的生长。此外，观察到肝纤维化小鼠肠道菌群组成发生改变，以及线粒体异常。LBO治疗重塑了细菌群落的组成，改善了微生物代谢物，如碳水化合物和维生素代谢物的水平，降低了结肠上皮的通透性和炎症反应，保持了健康的肠道微环境，增强了线粒体功能，改善了肝纤维化。这些结果对今后LBO在治疗肝纤维化和慢性肝病中的临床应用具有重要意义。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0944711323004282
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