导读
当归芍药散（DSS）是《金匮要略》中首次记载的一种中药。DSS已被证明可治疗肝纤维化（HF）。然而，DSS对HF的作用和机制尚不清楚。本研究旨在分析DSS通过肠道微生物群及其代谢产物（短链脂肪酸(SCFAs)，胆汁酸(BAs)）对HF的影响。我们用CCl4诱导HF大鼠，并用DSS处理；首先评估DSS对HF大鼠的疗效和对肠道屏障的保护作用；然后使用16S rRNA基因测序和非靶向粪便代谢组学初步探索了DSS治疗HF的机制，并鉴定了不同的微生物群和代谢途径；基于SCFAs和BAs的代谢，最后使用靶向代谢组学和RT-qPCR进一步验证了DSS治疗HF的机制。给药8周后，DSS显著降低了HF的程度。此外，DSS减轻了回肠的炎症，降低了LPS和D-乳酸的水平。DSS改变了肠道微生物群的结构，特别是韦永氏球菌、Romboutsia、Monoglobus、Parabacteroides、norank_f_Coriobacteriales_Incertae_Sedis。这些菌与SCFAs的产生和BA的代谢有关。非靶向代谢组学提示DSS可能通过BA的代谢发挥作用。随后，靶向代谢组学和RT-qPCR进一步证实了DSS在提高SCFAs水平和调节BAs代谢中的关键作用。因此，DSS可减轻CCl4诱导的HF，保护肠道屏障。DSS可能通过影响肠道微生物群及其代谢产物（SCFAs、BAs）对HF发挥有益作用。
研究热点：
1. DSS对CCl4诱导的肝纤维化和肠道屏障损伤具有保护作用；
2. DSS可以调节肠道微生物组成，促进SCFAs的产生，从而减轻肝纤维化；
3. DSS可以调节CCl4引起的肝脏、血浆和粪便中BA的紊乱；
4. DSS可以调节BA的合成、转运和重吸收，以减轻肝纤维化；
5. DSS可作为治疗HF的潜在治疗药物。
论文ID
原名：Bile acids metabolism involved in the beneficial effects of Danggui Shaoyao San via gut microbiota in the treatment of CCl4 induced hepatic fibrosis
译名：当归芍药散通过肠道菌群参与胆汁酸代谢对CCl4诱导肝纤维化的有益作用
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.11
通讯作者：王淼&赵春杰
通讯作者单位：沈阳药科大学
实验设计
实验结果
1. DSS可减轻CCl4诱导的HF
在本研究中，我们用Masson三色染色法观察了肝脏的病理变化。图2A显示HF大鼠门静脉区有大量胶原纤维增生，纤维桥连及结节明显。DSS处理后，三个DSS组和水飞蓟素（SYM，阳性药）组的胶原纤维增殖和纤维桥连显著减少。此外，三个DSS剂量组和SYM组的得分低于HF组（图2B）。三个剂量组的Ishak评分没有显著差异，但高剂量（DSSH）组的评分低于低剂量（DSSL）和中剂量（DSSM）组。此外，DSS显著降低了肝脏指数和脾脏指数，并增加了胸腺指数。
图1 动物实验流程图
2. DSS对肠道屏障的保护作用
我们对回肠进行了病理分析，以评估DSS对肠道屏障的影响。如图3A所示，CON组回肠绒毛形态完整，无明显炎症。与CON组相比，HF组肠绒毛减少并浸润大量炎症细胞。DSS处理后，三个DSS组的病理变化均得到缓解。
随后，我们检测了血浆中的脂多糖（LPS）和D-乳酸，以进一步研究肠道屏障的渗漏（图3B）。与CON组相比，HF组LPS和D-乳酸的浓度明显升高。DSS处理后，所有三个剂量的DSS中LPS均显著降低，而DSSM和DSSH组中D-乳酸显著降低。
图2 DSS对CCl4诱导的HF的影响
（A）肝脏Masson染色。（B）Ishak得分。（C）肝指数。（D）脾脏指数。（E）胸腺指数。与CON组比较：**P<0.01，*P<0.05；与HF组比较：##P<0.01，#P<0.05（黑色箭头表示胶原沉积）。
3. 16S rRNA基因测序分析
3.1 DSS处理对肠道微生物结构的影响
我们对16S rRNA基因测序进行分析，以研究CON、HF和DSSH组肠道微生物群的整体结构变化。从稀疏曲线（图S1a）来看，随着样本读数的增加，曲线都变得平滑，这表明测序深度是合理的，可以反映群落丰度水平。我们从18个样本中总共捕获了27490个序列和1037个OTU。PCoA（主坐标分析）和NMDS（非度量多维标度）显示CON、HF和DSSH组之间显著分离，表明CCl4和DSS处理导致肠道微生物群变化（图S1b）。Stress值小于0.2，表明NMDS分析可以准确反映样品之间的差异（图S1c）。层次聚类分析显示，DSSH和CON组之间的分离小于DSSH和HF组之间的间隔（图S1d）。结果表明，CON和DSSH具有相似的微生物群落结构。alpha多样性分析显示，CON、HF和DSSH组在sobs、ace和chao中没有显著差异（图S1e）。以上结果表明DSS可以调节肠道微生物群。
图3 DSS对肠道屏障的保护作用（n=6）
（A）回肠HE染色。（B）血浆中LPS和D-乳酸的水平。与CON组比较：**P<0.01，*P<0.05；与HF组比较：##P<0.01，#P<0.05（黑色箭头表示肠绒毛，蓝色箭头表示肠隐窝）。
3.2 DSS改善CCl4诱导的肠道微生物群紊乱
在门的水平上，厚壁菌门和拟杆菌门是主要的类群（>90%，图4A）。与CON组相比，HF组厚壁菌门的丰度降低，拟杆菌门丰度增加，DSS处理逆转了这一变化（图4B）。与CON组相比，HF组厚壁菌门与拟杆菌门（F/B）的比例降低，DSS显著逆转了这一变化。在属水平上（图4C），norank_f_Muribaculaceae、乳杆菌、Clostridium_sensus_stricto_1、Prevotellaceae_NK4B136_group是主要属。
图4 肠道微生物群组成的差异（n=6）
（A）门水平的群落条形图。（B）厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度和F/B的比例。（C）属水平的群落条形图。（D）CON和HF组之间的差异属。（E）HF和DSSH组之间的差异属。（F）Lefse分析的分支图。
然后我们分析了肠道微生物群的差异。Welch检验表明，21个属发生了显著变化。其中10个属在CON组和HF组之间表现出显著差异，包括Monoglobus、Parabacteroides、norank_f_norank_o_Gastranaerophiles、Papillibacter、Lachnospiracea_FCS020_group、norank_f_norank_o_Rodospirillales、韦永氏球菌、Rodentibacter、Anaerofustis、unclassified_k_norank_d_Bacteria（图4D）。此外，与HF组比较，DSSH逆转了Monoglobus、Parabacteroides、韦永氏球菌、norank_f_norank_o_Rodospirillales、unclassified_k_orank_d_Bacteria的变化，还增加了Faecalibaculum、Turicibacter、Clostridium_sensus_stricto_1、unssified_f-Eggerhellaceae、norank_f_Barnesiellaceae、norank_f_Coriobacterales_Incertae_Sedis、norank_f_norank_o_Coriobacteriales和Romboutsia的丰度（图4E）。
此外，我们还进行了Lefse分析（LDA>3.5，p<0.05），以发现CON、HF和DSS组中的优势微生物群（图4F）。数据显示，HF组富含g_Previotellaceae_UCG-001、g_Globicatella、g_Veillonella、g_Rodentibacter、g_norank_f_norank_o_RF39。此外，DSSH组中富集了g_Clostridium_sensus_stricto_1、g_Prevotellacea_NK3B31_group、g_Romboutsia、g_norank_f_Coriobacteriales_Incertae_Sedis、g_Monoglobus、g_Jeotgalicoccus、g_Coriobacteriaceae_UCG-002、g_Corinobacteriaceae、g_Phascolarctobacterium。综合以上结果，g_Veillonella、g_Rodentibacter、g_Romboutsia、g_Monoglobus、g_norank_f_Coriobacterales_Incertae_Sedis、g_Clostridium_sensu_stricto_1为DSS治疗HF的关键参与菌。
3.3 PICRUSt功能预测
为了研究DSS对肠道微生物群功能的影响，我们进行了KEGG富集分析。与CON组相比，HF组改变的主要途径是细胞生长和死亡、能量代谢、转运和分解代谢（图5A）。然而，DSS处理后，富集途径的改变是衰老、发育和再生、转运和分解代谢（图5B）。
图5 CON和HF之间（A）以及HF和DSSH之间（B）肠道微生物PICRUSt途径的差异
4. DSS对短链脂肪酸的影响
如前所述，DSSH组中SCFAs产生菌的丰度增加。因此，我们定量了盲肠内容物中的7种SCFAs（图6）。与CON组相比，HF组的总SCFA减少。相反，三个DSS剂量组的总SCFA明显更高。此外，HF组的丙酸、乙酸、丁酸和异丁酸水平低于CON组，戊酸、异戊酸和己酸含量无显著差异。DSS逆转了这些变化。此外，DSS显著增加戊酸含量。在三个DSS剂量组中，7种SCFAs和总SCFAs之间没有统计学差异。SCFAs，尤其是丁酸，可以保护肠道屏障，减少LPS的移位，从而进一步抑制巨噬细胞活化并产生炎症因子，从而保护肝脏。总体而言，DSS可以增加SCFA以缓解HF。
图6 DSS对SCFA的影响
盲肠内容物中（A）总SCFAs、（B）乙酸、（C）丙酸、（D）丁酸、（E）异丁酸、（F）异戊酸、（G）戊酸和（H）己酸的含量（n=6）。与HF相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
5. DSS调节粪便代谢谱
为了进一步鉴定受DSS影响的代谢产物，我们对粪便样本进行了一项非靶向代谢组学研究。CON、HF和DSSH组的Q-Exactive MS总离子色谱图（TICs）如图S2所示。1H NMR谱如图S3所示。通过1H NMR和Q-Exactive MS提取的代谢产物用Simca-P软件进行分析。在正离子、负离子模式下的3D-PCA（主成分分析）评分图（图7）和1H NMR中显示出三个实验组之间的明显分离。这表明CON、HF和DSSH组之间的代谢物存在显著差异。
为了阐明差异代谢物，我们进行了OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析）。我们通过1H NMR鉴定出CON组和HF组之间存在23种显著差异代谢物（VIP>1，p<0.05；表S2），通过Q Exactive MS鉴别出149种显著差异代谢物（VIP>1，p<0.01，|log2-Flod变化|>1；表S4）。其中，66种粪便代谢产物通过DSS处理逆转（表S5），这些差异代谢产物被认为是DSS改善HF的潜在关键代谢产物。
为了探索差异代谢产物的功能特征，我们进行了KEGG富集分析。图7F显示，在HF大鼠中，DSS显著破坏和调节三种途径，包括次级胆汁酸合成、精氨酸生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。
此外，我们观察到次级胆汁酸合成途径中许多代谢产物的显著富集（图7G）。与CON组相比，HF组有26种代谢产物存在显著差异，表明HF大鼠的BAs代谢受到干扰。DSSH组逆转了14个BAs，包括熊脱氧胆酸、鼠脱氧胆酸、猪脱氧胆酸（HDCA）、熊果胆酸、12-epideoxycholic acid、α-鼠胆酸、isochenodeoxycholic acid、allochenodeoxycholic acid、脱氧胆酸（DCA）、allodeoxycholic acid、ω-鼠胆酸、异脱氧胆酸、脱氢胆酸、石胆酸(LCA)。
图7 DSS调节HF大鼠（n=6）的粪便代谢
（A）CON、HF和DSSH的3D-PCA。（B）CON与HF的OPLS-DA图。（C）HF与DSSH的OPLS-DA图。（D）CON与HF的火山图。（E）HF与DSSH的火山图。（F）CON与HF和HF与DSSH之间的显著代谢途径。（G）与BAs代谢途径相关的代谢产物的Log2倍变化。
6. DSS对胆汁酸代谢的影响
粪便代谢组学研究表明，DSS可能调节BAs代谢。为了进一步研究DSS对BAs的影响，我们用LC-MS定量分析了肝脏、血浆和粪便中的BAs。
我们首先分析了肝脏中BA的组成。与CON组相比，HF组肝脏中的TBA显著较高，结合和非结合BA的比率较低，经DSS处理后恢复。这些变化主要归因于HF组胆酸（CA）、牛磺胆酸（TCA）和HDCA的增加。肝脏中单个BA的变化如图8A所示。与CON组相比，除鹅脱氧胆酸(CDCA)、DCA、LCA、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)外，HF组的个别BAs升高，而与HF组相比，DSS降低了CA、HDCA、甘胆酸（GCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA）、TCA、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）的水平，尤其是在DSSM和DSSH组中。
然后，我们量化了血浆中BA的组成。与CON组相比，HF组血浆中的TBA升高，DSS组血浆中TBA降低。此外，HF组的初级和次级BA的比率以及结合性和非结合性BA的比例高于CON组，DSS显著逆转了这些变化（图8B）。此外，HF组个体BA升高，与HF组相比，DSS降低了CA、LCA、GCDCA、TCA、GDCA、GUDCA、GCA、CDCA和TUDCA的水平。一些BA随着DSS剂量的增加而减少。
BA是肠道微生物群的代谢产物，也会反过来调节肠道微生物群。与CON组相比，HF组粪便中的TBA降低。而DSS处理增加了粪便TBA。此外，HF组的初级和次级BA的比例以及结合性和非结合性BA的比率更高，DSS处理以剂量依赖性的方式显著逆转了这一变化。这些变化是由单个BA的变化驱动的（图8C）。与CON组相比，HF组增加了GCA、TCA、TUDCA、CA的浓度，降低了TCDCA、GDCA、GUDCA、TLAC、DCA、HDCA、LCA的浓度。DSS逆转CCl4诱导的BAs改变。此外，DSS处理后，一些BAs以剂量依赖的方式发生改变。
总体而言，DSS减轻了CCl4诱导的BAs代谢紊乱，从而缓解HF。
图8 DSS处理大鼠BAs谱的变化（n=6）
肝脏（A）、血浆（B）和粪便（C）中总BA的浓度、结合与非结合以及初级与次级BA的比率以及单个BA的浓度。*P＜0.05，**P＜0.01，与CON比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与HF比较；+P＜0.05，++P＜0.01，与DSSL比较；与DSSM相比^^P＜0.01。
7. DSS对肝脏胆汁酸代谢酶和转运蛋白及粪便BSH活性的影响
为了进一步验证DSS对BA代谢的影响，我们通过RT-qPCR检测了与BA合成、结合、转运和重吸收相关的基因。与CON组相比，CCl4处理后，CYP7A1、CYP27A1、CYP8B1、BAAT、BACS、MRP2、BSEP和NTCP的表达降低（图9）。在DSSM和DSSH组中，BAAT、BACS、MRP2、BSEP和NTCP的表达增加，表明DSS加速了BAs的代谢。此外，DSS增加了CYP7A1、CYP27A1、CYP8B1的表达，表明DSS调节了BA的合成。为了进一步验证，我们通过ELISA试剂盒研究了肝脏中的CYP7A1、CYP8B1、NTCP和BSEP。如图9所示，HF组的CYP7A1、CYP8B1、BSEP和NTCP水平显著低于CON组，DSS处理后这些变化得到逆转。这些数据表明DSS可以调节CCl4诱导的BAs代谢紊乱。
此外，我们测定了BSH的活性（图9E）。与CON组相比，HF组的BSH活性降低。与HF组相比，DSSM和DSSH组的BSH增加。
8. DSS对肝纤维化相关属的影响
在之前的一项研究中，我们评估了DSS对血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、III型前胶原N基端肽（PIIINP）、IV型胶原（CIV）、透明质酸酶（HA）和层粘连蛋白（LN）的影响。这些指标的数据（补充表S2）在本研究中用于进一步的Spearman与关键肠道微生物群的相关性分析，以调查与HF相关的属（图10A）。有9个菌属与HF相关指标密切相关，包括unclassified_k_norank_d_Bacteria、Anaerofustis、Rodentibacter、韦永氏球菌、norank_f_norank_o_Rhodospirillales、Papillibacter、norank_f_norank_o_Gastranaerophilales、Parabacteroides（正相关）和Lachnospiracae_FCS020_group（负相关）。其中unclassified_k_norank_d_Bacteria、韦永氏球菌、norank_f_norank_Rodospirillales和Parabacteroides被DSS显著逆转。因此，这些属可能是HF治疗DSS的关键属。
9. 关键微生物属与粪便胆汁酸和短链脂肪酸相关
为了研究SCFAs与肠道微生物群之间的关系，我们进行了Spearman相关性分析（图10B）。肠道微生物群与短链脂肪酸密切相关。Unclassified_k_norank_d_Bacteria、Rodentibacter、韦永氏球菌、Butyricimonas、Parabacteroides、norank_f_norank_Rodospirillales与大多数SCFA呈负相关。Clostridium_sensus_stricto_1、norank_f_Coriobacteriales_Incertae_Sedis、Monoglobus、Romboutsia与大多数SCFA呈正相关。
此外，图10C显示了肠道微生物群和BA之间的强相关性。Unclassified_k_norank_d_Bacteria、Rodentibacter、韦永氏球菌、Parabacteroides与GDCA、GUDCA、DCA、LCA呈负相关。Rodentibacter、韦永氏球菌与GCA、TUDCA、CA呈正相关。norank_f_norank_o_Rhodospirillales与GDCA、GUDCA呈负相关。
图10 Spearman相关性分析
差异属与（A）HF相关指标、（B）SCFA和（C）BA之间的相关性。（D）韦永氏球菌、Rodentibacter、norank_f_Coriobacteriales_Incertae_Sedis、Monoglobus、Romboutsia和Clostridium_sensus_stricto_1的相对丰度（n=6）。
讨论
在之前的研究中，我们发现DSS降低了ALT、AST、PIIINP、CIV、HA和LN，并证实DSS可以通过改善氧化应激和炎症来减轻CCl4诱导的HF。在本研究中，我们观察了肝脏的Masson染色和肝脏指数，发现DSS降低了肝脏指数和HF程度。此外，回肠组织的H&E染色和血浆中LPS和D-乳酸的浓度也表明DSS保护肠道屏障，减少肠道毒素进入身体循环。
HF会改变肠道微生物群，从而进一步加剧HF。16S rRNA测序结果表明，韦永氏球菌、Rodentibacter、Clostridium_sensustricto_1、Romboutsia、Monoglobus、norank_f_Coriobacterales_Incertae_Sedis是DSS调控的关键微生物群。对11个HF相关指标与关键菌属进行了Spearman相关性分析。其中，unclassified_k_norank_d_Bacteria、韦永氏球菌、norank_f_norank_o_-Rhodospirillales和拟杆菌与HF相关指标呈正相关。韦永氏球菌是一种革兰氏阴性细菌，产生LPS以加剧炎症。此外，韦永氏球菌是BAs敏感菌，在肝硬化中富集，抑制BAs代谢。Clostridium_sensu_stricto_1和Romboutsia产生SCFA，保护肠道屏障并减少炎症。此外，Romboutsia与BA显著相关。Monoglobus在健康个体中富集，并具有发酵膳食纤维产生丁酸盐的能力，丁酸盐可抑制炎症和氧化应激。Coriobacterles_Incertae_Sedis与丙酸水平和BAs代谢有关。
SCFA可以调节宿主代谢，保护肠道屏障，对宿主健康至关重要。DSS增加了SCFA产生菌的丰度（Clostridium_sensus_stricto_1、Romboutsia、Monoglobus、norank_f_Coriobacteriales_Incertae_Sedis、Faecalibacterium，图10B）。相关分析还表明，这些肠道微生物群与短链脂肪酸密切相关。丁酸已被证明可以上调toll样受体2（TLR2）的表达，并通过NF-κB信号通路保护肠道屏障。
肠道微生物群的变化也会改变粪便代谢产物，从而促进HF的发展。PICRUSt对肠道微生物群进行的预测表明，DSS会改变HF大鼠的代谢途径。为了进一步分析代谢物的变化，我们对粪便样本进行了非靶向代谢组学分析。CON、HF和DSSH组的代谢产物有显著差异。KEGG对差异代谢产物的富集分析表明，DSS可能通过调节次级BAs代谢来减轻HF。
BAs与HF之间有很强的相关性。研究表明，HF的特征是BAs的积累，而BAs在肝脏中的积累可能是促进HF发展的潜在因素。HF患者血清/血浆TBA显著升高，粪便BA较低，这与我们的结果相同。我们发现HF组肝脏中的CA和TCA升高，DSS处理组则相反。CA是疏水性的，疏水性BA会损伤肝细胞，刺激氧化应激并加剧HF。TCA诱导HSC活化，导致α-SMA的显著表达并促进HF。此外，CCl4降低了肝脏中结合和非结合BA的比例，但DSS处理组的这一比例增加了。这可能与通过结合BACS和BAAT降低BA的疏水性和毒性有关。研究表明，血清总BA水平和肝功能指标可用于预测HF的程度。有证据表明，随着肝病的恶化，粪便中的总胆汁酸减少，次级胆汁酸与初级胆汁酸的比例降低。肠道微生物群可以通过去耦合、脱羟基、氧化和异构化将初级BA转化为次级BA。继发性BA的减少与肠道微生物群有关。相关性分析表明，包括GDCA、GUDCA、DCA、LCA和TUDCA在内的次级BA与肠道微生物群具有很强的相关性。由于HF组中BSH酶活性降低，粪便中结合与非结合BA的比例增加。HF组粪便TBA降低，DSS处理后粪便TBA呈剂量依赖性增加，这表明HF组BA的粪便排泄减少，DSS逆转了这一变化。
BAs稳态主要由肝脏I相和II相的代谢酶和BAs摄取/流出转运蛋白介导。在肝损伤中，CYP7A1活性受到抑制，导致BAs合成减少，从而减轻BAs诱导的细胞毒性。这解释了为什么HF组中与BA合成相关的酶（CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1）减少。DSS处理显著上调CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1的水平。BA在肝细胞和胆管之间的转运是BA从肝脏排出的关键步骤，BSEP和MRP2在这一过程中至关重要。BSEP主要参与未结合的BA运输（这些BA比结合的BA毒性更大）。MRP2调节许多有机阴离子的流出，包括胆红素和结合BA。在CCl4诱导的肝损伤中，MRP2和BSEP的表达降低，导致BA和其他物质通过胆管的排泄受损。肝脏在肝细胞基底外侧表面以5-10倍的浓度梯度进行BAs再摄取，并且该过程通过NTCP介导。据报道，NTCP在胆汁淤积性疾病中的表达减少。从黄蜀葵花中提取的总黄酮通过上调BSEP、MRP2和NTCP对胆汁淤积症期间的肝脏具有保护作用。在本研究中，DSS显著上调了BSEP、MRP2和NTCP的表达，它们参与了肝胆运输的调节。我们推测DSS通过增加BAs的合成和外排来调节肝脏中BAs的水平。此外，DSS还增加了BAs的粪便排泄。
结论
在这项研究中，我们发现DSS在治疗HF大鼠和保护肠道屏障方面是有效的，并且DSS可能通过调节肠道微生物群和改变肠道代谢产物（SCFAs、BAs）来发挥抗肝纤维化作用。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37925004/
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