导读
为了揭示小檗碱（BBR）治疗糖尿病视网膜病变（DR）的核心机制，采用四维独立数据采集（4D-DIA）蛋白质组学结合生物信息学分析和实验验证。通过腹腔注射链脲佐菌素建立DR损伤模型。BBR给药后8周，对各组视网膜进行光学相干断层扫描（OTC）照片和苏木精-伊红染色，然后收集视网膜进行4D-DIA定量蛋白质组学检测。此外，分别进行了差异蛋白分析、基因本体论（GO）富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以及分子对接。在实验部分，采用蛋白质印迹（WB）和免疫荧光染色来确认定量PCR检测中最重要的分子之一碳酸酐酶1（CA1）的变化和分布。最后，使用RNA敲除来确定CA1在给予小檗碱的视网膜色素上皮细胞（RPEs）中的关键作用。OCT检测显示，与假手术（Sham）组相比，DR组RPE的外核、内层和外附属层变薄，而与DR组相比，给药后RPE各层变厚。通过蛋白质组学分析和Venny杂交图筛选出10种蛋白质，其中DENN结构包含域1A基因（DENND1A）和UTP6小亚基加工体（UTP6）被下调，DR组ATPase铜转运α（ATP7A）、periplakin（PPL）、骨甘氨酸（OGN）、nse1同源物（NSMCE1）、膜金属内肽酶（MME）、lim domain only 4（LMO4）、CA1和纤连蛋白1（FN1）表达上调，BBR处理可有效逆转其表达。PPI结果显示，10种蛋白质相互作用，但只有ATP7A、FN1和OGN表现出直接相关。此外，我们基于蛋白质组学检测中发现的10种蛋白质，将网络中多达15个基因的连锁关系扩大，以进行深度GO和KEGG分析。因此，最重要的生物过程涉及rRNA处理；最重要的细胞成分是小亚基加工体；最重要的分子功能是磷脂结合；在真核生物中，KEGG途径是核糖体生物发生。此外，分子对接表明，LMO4、ATP7A、PPL、NSMCE1、MME、CA1可以与BBR形成稳定的分子结合模式。其中，DR组CA1、PPL和ATP7A的mRNA表达和CA1蛋白水平升高，BBR组降低。最后，CA1 RNA敲除证实了CA1在BBR给药的RPE中的关键作用。本研究结果证实了BBR在DR治疗中的作用，并解释了相关的分子网络机制，其中CA1可被认为是小檗碱治疗保护RPEs的关键候选分子。
论文ID
原名：4D-DIA quantitative proteomics revealed the core mechanism of diabetic retinopathy after berberine treatment
译名：4D-DIA定量蛋白质组学揭示了小檗碱治疗后糖尿病视网膜病变的核心机制
期刊：European Journal of Pharmacology
IF：5
发表时间：2023.9
通讯作者：王廷华、刘学政和左中夫
通讯作者单位：昆明医科大学和锦州医科大学
实验设计
实验结果
1. 形态学观察
Sham组存在异常形态学特征，而DR组的RPEs外核和内膜边界核心层厚度明显薄于Sham组。相比之下，与DR组相比，BBR组的RPEs外核、内膜边界核心层和外部形态层厚度增厚（图1）。。
图1 Sham、DR和BBR组的OCT眼底图像。（A）Sham组的OCT图像。（B）DR组OCT图像。（C）BBR组OCT图像。（D）三组视网膜厚度的定量分析（DR组，糖尿病大鼠；BBR组，用小檗碱治疗DR大鼠）。*，#表示P＜0.05。
2. HE染色
HE染色结果显示，与Sham组相比，DR组视网膜结构排列疏松，色素上皮细胞层和神经纤维层呈现不同程度的变性、脱落和减少。与DR组相比，BBR组的视网膜结构变得更紧密。液泡数量减少，细胞形态改善。定量分析显示，与Sham组相比，DR组的视网膜厚度显著降低（P<0.001）。与DR组相比，BBR组大鼠视网膜厚度明显增加（P < 0.001），具有统计学意义（图2）。
表1 被检测基因引物
图2 视网膜组织H&E染色切片的定量。（A）BBR治疗的糖尿病视网膜病变大鼠视网膜组织的HE染色。（B）每组的视网膜厚度。（Sham：正常对照组；DR：糖尿病视网膜病变组；BBR：治疗组。RPE：视网膜色素上皮；ONL：外核层；INL：核层；RGC：视网膜神经节细胞。Bar = 50 μm）。
3. Sham、BBR和DR组的差异蛋白分析
对测序数据进行整理，并用蛋白质图谱对筛选出的数据进行鉴定。使用P < 0.05和logFC>0.5作为筛选条件，Sham组中发现73种蛋白质，DR组中发现140种蛋白质，BBR组中也有140种蛋白质（表2）。然而，通过Venny交叉，三组中的串扰蛋白检索仅发现10种核心蛋白，即ATP7A、CA1、DENND1A、FNL、LMO4、MME、NSMCEL、OGN、PPL和UTP6（图3，A）。
表2 蛋白质组学分析的原始数据
图3三组之间的生物信息学分析。（A）Sham、DR和BBR之间共享蛋白质的维恩图。（B）每组10个核心蛋白的表达水平。红色表示上调的蛋白质，蓝色表示下调的蛋白质。（红框表示向上，蓝色表示向下；C为Sham组，E为糖尿病视网膜损伤组，D为小檗碱药物治疗组）。（C）从10个蛋白质（C-1）到15个蛋白质（C-2）的蛋白质相互作用图。（D）GO富集分析（D-1）和KEGG途径分析（D-2）。
4. 关键蛋白水平的比较
通过蛋白质组学筛选分析了10种核心蛋白的水平，如图3、B所示。其中DENND1A和UTP6水平下调，而ATP7A、PPL、OGN、NSMCE1、MME、LMO4、CA1和FN1在DR组中上调。相比之下，在BBR组中，DENND1A和UTP6分别上调，但ATP7A、PPL、OGN、NSMCE1、MME、LMO4、CA1和FN1分别下调。
5. PPI蛋白相互作用
将10个蛋白质放入String中观察蛋白质相互作用，得出只有ATP7A、FN1和OGN相互连接的结论（图3、C）。其他七种蛋白质之间没有相互作用。相互作用最密切的前十对蛋白质是DENND1A/RAB35；FN1/ITGAV/ITGAV FN1；RAB35/DENND1A；RRP9/UTP6；UTP18/UTP6；UTP18/UTP3；UTP3/UTP18；UTP3/UTP6；UTP6/UTP18（图3，C-1）。此外，我们连续输入String中的10种蛋白质，然后点击“更多”，得到与输入的10种蛋白相关的15种蛋白质，分别命名为OGN、FN1、ITFAV、ATP7A、NSMCE1、CA1、LMO4、PPL、DENND1A、RAB35、MME RRP9、UTP3、UTP18、UTP6（图3，C-2）。
6. GO和KEGG分析
对从其基因转移的15个基因进行GO富集和KEGG途径分析，获得生物学过程（图3，D）。最重要的生物过程是rRNA处理；最重要的细胞群是小亚基加工体；最重要的分子功能是磷脂结合。（图3，D-1）；然而，KEGG途径是真核生物中核糖体的生物发生（图3，D-2）。
表3 每种蛋白质的结合能
7. 分子对接
我们对ATP7A、CA1、DENND1A、FNL、LMO4、MME、NSMCEL、OGN、PPL和UTP6进行了分子对接验证。这些蛋白质的结合能如表3所示。重要的是，如图4所示，ATP7A、CA1、DENND1A、LMO4、MME、NSMCE1和PPL蛋白可以与BBR形成稳定的分子结合模式，表明这些蛋白与BBR具有良好的结合活性，而FN1、OGN和UTP6蛋白不能与BBR对接（图4）。最后，在表3中分析并展示了每种蛋白质的结合能。
图4 10种共享蛋白质与BBR的分子对接。A. ATP7A与小檗碱的分子对接。B. CA1与小檗碱的分子对接。C. Dennd1a与小檗碱的分子对接。D. FN1与小檗碱的分子对接。E. Lmo4与小檗碱的分子对接。F. MME与小檗碱的分子对接。G. Nsmce1与小檗碱的分子对接。H. OGN与小檗碱的分子对接。I. PPL与小檗碱的分子对接。J. UTP6与小檗碱的分子对接。
8. 定量PCR验证
7种蛋白质可以通过分子对接进行对接，包括Dennd1a、Nsmce1-Lmo4、CA1、Ppl、Mme和Atp7a，并通过定量PCR进行验证。其中CA1、Ppl、Atp7a 3个蛋白（P < 0.05）具有统计学意义。具体而言，DR组的CA1和Pp1水平与假手术组相比显著升高，而BBR组有显著下降。然而，Atp7a的水平表现出与CA1和Pp不同的反向变化趋势。其他蛋白包括Dennd1a、Nsmce1、Lmo4和Mme）在该观察中没有统计学显著差异（P > 0.05）（图5）。
图5 通过q-PCR显示DR中DENND1A、NSMCE1 LMO4、CA1、PPL、MME和ATP7A的相对表达。
9. WB显示各组CA1水平
在假手术中，可以识别检测到的CA1表达水平。高糖损伤后视网膜CA1蛋白水平明显升高，与对照组比较有显著性差异（P＜0.001）。相比之下，给予BBR导致CA1水平显著下调，具有统计学意义（P<0.001）。因此，目前的数据证实了DR中CA1的蛋白质水平在BBR治疗后增加，然后降低（图6）。
图6 假手术组、DR组和小檗碱组CA1蛋白水平。（A）显示各组WB检测的成像（n = 3）。（B）显示定量比较。
10. 小檗碱对敲除RPE CA1的作用
显微镜下，RPEs生长良好。与正常对照组相比，高浓度葡萄糖组的RPEs活力显著降低（P<0.05）。然而，与未经BBR处理的RPE相比，小檗碱处理后的RPE活力显著恢复（P<0.05），这表明BBR在高浓度葡萄糖作用下的RPE中起着保护作用。为了研究RPEs损伤的核心机制和BBR的保护作用，本研究采用了RNA干扰试验。结果显示，与不干预组相比，CA1干扰组RPEs的细胞活力显著恢复（P<0.05），这表明CA1可能是RPEs损伤的重要因素。此外，在用CA1干扰的BBR治疗后，RPEs的生存能力相对于单一BBR治疗组进一步显著提高。这表明CA1在BBR对RPEs生存能力的保护作用中起着关键作用。我们共同证实，CA1在RPE中对BBR抗高糖损伤的保护作用中起着至关重要的作用（图7）。
图7 各组细胞活力比较。A、 B、C、D、E、F、G、H显示两组之间的细胞活力比较。HG：高糖，HGr：高糖加随机碱基对对照，BHG：高糖加BBR给药，isCA1:CA1干扰RNA。
讨论
在本研究中，我们建立了糖尿病视网膜损伤模型，并给予BBR 8周。OCT和HE染色显示DR中RPEs的外核、内层和外附属层变薄，但BBR处理后变厚。通过对蛋白质组学数据的筛选和Venny杂交图的绘制，可以确定10个蛋白质，点击更多的关系可以扩增出15个蛋白质。根据q-PCR结果，DR中ATP7A、PPL、OGN、NSMCE1、MME、LMO4、CA1和FN1的表达上调，而BBR治疗组则相反。PPI结果显示，只有ATP7A、FN1和OGN相互连接，而其他7种蛋白质之间没有相互作用。因此，将15个核心蛋白转移到基因中进行GO和KEGG分析。分子对接结果证实，除FN1、OGN和UTP6靶蛋白外，BBR可与其靶蛋白形成稳定的分子结合模式。PCR结果显示，DR组CA1、PPL和ATP7A的表达在统计学上增加，而BBR组则有所下降。最后，WB和RNA敲除报道了CA1在给予BBR的RPE中的表达和关键作用。这些发现支持BBR对DR的治疗作用，其核心机制涉及分子网络调控，其中CA1似乎是最重要的。
1. OCT和HE的发现及其启示
糖尿病视网膜病变（DR）是一种严重致盲的神经血管疾病。为了研究小檗碱对DR的保护作用，我们进行了动物实验，。因此，通过OCT检测和HE染色显示，小檗碱对视网膜修复具有保护作用。据报道，小檗碱可以保护视网膜形态免受高血糖损伤，减少糖原积累。我们的数据为小檗碱给药促进DR修复增加了新的形态学证据，因为通过OCT观察和HE染色，BBR给药组的视网膜厚度增加了。
2. Venny和核心蛋白分析
我们收集蛋白质组学数据进行Venny交叉分析，发现Sham组有73种蛋白质，DR组有140种蛋白质，BBR组有140个蛋白质。经Venn图杂交得到10个共存蛋白，分别命名为DENNE1A、UTP6、FN1、NSMCE1、LMO4、CA1、OGN、PPL、MME和ATP7A。DENNE1A蛋白的多态性与肥胖有关，糖尿病病变后会出现肥胖并发症。UTP6是一种可以参与核糖体生物发生的蛋白质。FN1是细胞外基质的积累成分，在高血糖的情况下，它也是一种存在于血浆和细胞外基质中的糖蛋白。NSMCE1蛋白已被报道可维持基因组完整性。LMO4可以增殖并抑制细胞凋亡、氧化应激和现有的炎症反应，还可以减少视网膜色素上皮细胞的损伤。DR模型化后，海马CA1区广泛受损。OGN是骨和葡萄糖的稳态介质，也有助于调节葡萄糖代谢。糖尿病会导致进食后PPL（血脂）升高，肥胖环境中会产生与胰岛素抵抗相关的代谢活化（MME）细胞群。据报道，ATP7A通过细胞外超氧化物歧化酶对糖尿病内皮功能障碍具有保护作用。热图差异表达显示，DM组有两种下调蛋白，即Dennd1a和UTP6，8种上调蛋白，即ATP7A、PPL、OGN、NSMCE1、MME、LMO4、CA1和FN1。相比之下，BBR组中有8种下调蛋白，即ATP7A、PPL、OGN、NSMCE1、MME、LMO4、CA1和FN1，以及2种上调蛋白，分别为DENND1A和UTP6。这表明DR中有多种蛋白质发生变化，并且在BBR治疗中可能受到调节。
3. PPI蛋白相互作用
将10个蛋白质放入String中进行PPI蛋白质相互作用，得出只有ATP7A、FN1和OGN相互连接的结论。其他七种蛋白质之间没有相互作用。相互作用最密切的前十对蛋白质是DENND1A/RAB35；FN1/ITGAV；ITGAV/FN1；RAB35/DENND1A；RRP9/UTP6；UTP18/UTP6；UTP18/UTP3；UTP3/UTP18；UTP3/UTP6；UTP6/UTP18。然后我们将OGN、FN1、ITGAV、ATP7A、NSMCE1、CA1、LMO4、PPL、DENND1A、RAB35、MME RRP9、UTP3、UTP18、UTP6的蛋白质对从10扩增到15，然后构建更多的核心蛋白连接。最后，将这15种蛋白质提供给GO和KEGG分析，并获得了一些发现。由于分子对之间的关系是全新的，它们的功能含义需要在以后的实验中进行测试。
4. GO富集、KEGG通路分析及分子对接
对从其蛋白质中转移的15个基因进行GO富集和KEGG通路分析。因此，最重要的生物过程、细胞成分和分子功能分别是rRNA加工、小亚基加工体和磷脂结合。而在真核生物中，KEGG途径是核糖体生物发生。这表明筛选的蛋白质的生物学意义与rRNA功能和核糖体生物发生直接相关。分子对接证实了10种蛋白质是小檗碱的受体，除FN1和OGN未能与小檗碱配体成功对接外，其余8种蛋白质DENND1A、UTP6、NSMCE1、MME、LMO4、CA1、PPL和ATP7A均能与该药物对接。因此，小檗碱可以在直接调节这些蛋白质的基础上改善DR。尽管生物信息学分析和网络药理学提供了几种信息，但信号通路中的核心分子及其相互关系仍有待于实验验证。
5. PCR验证
用PCR方法检测DENN1A、NSMCE1、LMO4、CA1、PPL、MME和ATP7A的表达（P<0.05），其中CA1、PPL和ATP7A 3个基因具有统计学意义。特别是用小檗碱治疗后，CA1基因表达显著下降，提示CA1参与了小檗碱的治疗。PPL基因与血脂有关，血脂升高会导致糖尿病的发生，提示PPL是心血管疾病的重要危险因素。而小檗碱治疗降低了PPL基因的表达，提示PPL对糖尿病视网膜损伤具有调节作用。此外，ATP7A是一种铜转运蛋白，在细胞外铜增加的条件下重新定位到质膜上，并在铜从细胞流出的过程中发挥作用。据报道，内皮功能障碍是导致糖尿病的血管并发症，而ATP7A表达的恢复可以保护内皮功能障碍。因此，小檗碱治疗提高ATP7A的表达水平可用于DR的恢复。所有这些证据都支持了我们实验中筛选的分子，对小檗碱给药条件下DR的修复具有重要意义。
6. WB验证
通过使用WB，我们发现在小檗碱治疗的大鼠中，DR中的CA1水平显著上调和显著下调，这表明了DR和小檗碱给药中CA1的重要性。此前有报道称，CA1可通过补体1抑制剂或中和prepotassium和缓激肽受体的抗体拮抗作用诱导视网膜水肿。然而，小檗碱是否能调节CA1以保护DR免受损伤，这一点尚不明确。在此，我们报道了小檗碱在DR中表现出更有效的局部作用，因此它为DR的治疗提供了一种最佳策略， CA1可能是该过程中的核心机制。
7. CA1在小檗碱引起RPE中的作用
在本研究中，我们发现DR组的CA1蛋白水平升高，而小檗碱治疗的大鼠CA1蛋白质水平降低，证实CA1可能在DR和BBR给药中起重要作用。碳酸酐酶（CA）是一种具有不同结构、分布和性质的含锌金属酶，主要与各种上皮细胞中的H-和碳酸氢盐分泌有关，并通过催化CO2水合和某些脂质和醛类的水合来参与各种离子交换反应，以维持体内环境的稳态。CA1作为含锌单体抗氧化标志物，首次从红细胞中分离出来，在监测糖尿病并发症中发挥作用。CA1在早期糖尿病视网膜病变的病理性血管舒张治疗中缺乏相关性。大鼠玻璃体注射CA1增加视网膜血管渗漏并引起视网膜内水肿。补体1抑制剂、中和prepotassium和缓激肽受体的抗体拮抗作用可减少CA1诱导的视网膜水肿。大鼠硬膜下输注CA1可诱导脑血管通透性，提示细胞外CA1可能与神经血管水肿有广泛相关性。抑制细胞外CA1和激肽释放酶介导的先天性炎症可以为治疗出血诱导的视网膜和脑水肿提供新的治疗机会。最近的报道表明，全身作用和局部作用的磺酰胺CA1在治疗黄斑水肿、黄斑退行性疾病或糖尿病视网膜病变方面都是有效的。同时，研究正在寻求更有效的局部作用CA1，而不会出现目前可用药物的不便和副作用。总之，CA1可能是小檗碱治疗DR的关键靶点。
结论
在本研究中，我们基于蛋白质组学和实验验证，确定了小檗碱的关键靶点，并解释了小檗碱对抗糖尿病视网膜病变的核心机制。虽然DENNE1A、UTP6、FN1、NSMCE1、LMO4、CA1、OGN、PPL、MME和ATP7A蛋白与小檗碱对糖尿病视网膜病变的保护作用密切相关，但定量PCR仅鉴定出CA1、PPL和ATP7A，免疫印迹证实了CA1。最后，RNA敲除报道了CA1在给予小檗碱的RPE中的关键作用，这支持CA1是小檗碱给药大鼠DR最重要的调节之一。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0014299923004594?via%3Dihub
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