基于肠道微生物群和代谢物探究片仔癀抑制结直肠癌的作用机制
结直肠癌（CRC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。近年来，随着生活水平的提高和饮食习惯的改变，我国结直肠癌发病率呈现显著上升的趋势，由结直肠癌带来的健康问题日益严峻。片仔癀（PZH）是一种公认的传统药物，对炎症和癌症的治疗均有重要作用，现有研究表明其能通过抑制细胞增殖来抑制结直肠癌，然而作用机制尚不明确。香港中文大学于君团队基于肠道微生物群和代谢物探究了片仔癀抑制结直肠癌的作用机制。
该文章“Traditional Medicine Pien Tze Huang Suppresses Colorectal Tumorigenesis through Restoring Gut Microbiota and Metabolites”于2023年9月发表于Gastroenterology (if29.4)杂志。
研究背景
结直肠癌是全球第四大确诊和第三大致命癌症[1]。除了遗传因素外，现有研究证明肠道菌群失调有助于结直肠癌的发生和发展[2-6]，人体肠道微生物群的组成受饮食、生活方式和药物等因素的调节。越来越多的证据表明，中药发挥其治疗作用是通过调节肠道微生物群和代谢物实现的[7,8]。此外，肠道菌群可以代谢中药成分，从而影响药物疗效[9,10]。因此，了解中医药与肠道菌群之间的双向串扰，对于中医药在疾病预防和治疗中提供药理学新见解至关重要。
片仔癀由麝香、牛黄、蛇胆、三七根等组成，由于其对包括癌症在内的各种炎症疾病均有一定的治疗作用而受到广泛关注。最近有研究发现，片仔癀在体外通过抑制Wnt/β-catenin信号传导抑制结直肠癌细胞的增殖[11,12]。然而，其发挥作用的生物学基础以及片仔癀与肠道微生物群之间的潜在相互作用尚不清楚。本文采用自发性结直肠癌和无菌小鼠模型来研究片仔癀-肠道微生物群串扰在预防结直肠癌中的作用，并证明了片仔癀能抑制结直肠癌的发生。
研究内容
Result 1 片仔癀抑制AOM/DSS小鼠和Apcmin/+小鼠的结直肠癌
为了探究片仔癀在结直肠癌发生中的化学预防作用，作者每天给AOM/DSS处理的小鼠灌胃片仔癀，剂量为每日270 mg/kg（低）、540 mg/kg（高）（图1A）。结果发现片仔癀剂量依赖性地抑制结直肠癌发生率（图1B），对照组、低剂量片仔癀组和高剂量片仔癀组的肿瘤发生率分别为100%、66.67%和37.5%（图1C）。高剂量片仔癀显著抑制肿瘤数量和大小（图1C）。通过H&E和Ki-67染色发现，高剂量片仔癀显著降低了结肠癌的发生率，抑制了细胞增殖（图1D）。接下来，作者验证了片仔癀在Apcmin/+小鼠中的化学预防作用（图1E）。高剂量片仔癀显著降低了Apcmin/+小鼠的结肠肿瘤数量和大小（图1F,G）。此外，高剂量片仔癀降低了结肠癌的发生率和增殖细胞的百分比（图1H）。由此可知，片仔癀在致癌物质诱导的结直肠癌模型和转基因Apcmin/+结直肠癌模型中均具有化学预防作用。接下来，作者通过将片仔癀与Regorafenib（一种批准用于转移性结直肠癌的多激酶抑制剂）进行对照发现在AOM/DSS和Apcmin/+小鼠模型中，片仔癀的抗癌效果与Regorafenib相当，并且片仔癀处理后的小鼠没有产生不良反应。
图1 在AOM/DSS处理小鼠和Apcmin/+小鼠中，片仔癀剂量依赖性地抑制结直肠肿瘤的发生。（A）片仔癀对AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠模型的实验设计。（B）AOM/DSS处理后的小鼠结肠的代表性图像。（C）AOM/DSS处理小鼠对照组（n=14）、片仔癀 270mg/kg （n=15）、片仔癀 540mg/kg （n=15）小鼠肿瘤发生率、肿瘤数量和肿瘤体积。（D）小鼠结肠病理诊断的H&E染色和Ki-67的IHC染色。定量分析病理评分标准为:正常0分，LGD 1分，HGD 2分，癌3分。小鼠结肠Ki-67免疫组化染色及Ki-67指数定量分析。（E）片仔癀对Apcmin/+小鼠模型的实验设计。（F）Apcmin/+小鼠结肠的代表性图像。（G）Apcmin/+小鼠对照组（n=14）、片仔癀 270mg/kg （n=14）、片仔癀 540mg/kg （n=15）的肿瘤发生率、肿瘤数量、肿瘤体积。（H）小鼠结肠病理诊断的H&E染色和Ki-67的IHC染色。病理评分和Ki-67定量分析与AOM/DSS处理小鼠相同。采用单因素方差分析计算统计学显著性。
Result 2 片仔癀逆转结直肠癌患者肠道生态失调
为了确定片仔癀是否在结直肠癌发生过程中调节肠道微生物群，作者对两种结直肠癌模型的粪便样本进行了鸟枪宏基因组测序分析。基线时，不同组之间的肠道微生物群组成在α和β多样性方面没有显著差异，但片仔癀处理后，α多样性显著提高。主坐标分析（PCoA）显示片仔癀重塑了两个结直肠癌模型中的肠道微生物群（图2A，B）。虽然门水平上对照组和片仔癀组之间没有显著差异，但在种水平上，片仔癀处理后，48种细菌有显著变化。在两个结直肠癌模型中，与基线相比，片仔癀均可恢复非片仔癀治疗组中多种失调的细菌，这表明片仔癀从整体上恢复了健康的微生物群。在两种模型中，益生菌Pseudobutyrivibrio xylanivorans及Eubacterium limosum的丰度增加。此外，在AOM/DSS模型中，益生菌Lactobacillus acidophilus17、Lactobacillus gallinarum18、Lactobacillus johnsonii19和致病菌Campylobacter jejuni20、Peptoniphilus harei21、Aeromonasveronii22、Collinsella aerofaciens23均被富集（图2C）。在Apcmin/+小鼠模型中益生菌Lactococcus lactis、Streptococcus thermophilus、Akkermansia muciniphila被富集。接下来，作者从片仔癀组和对照组之间鉴定的差异细菌中构建生态网络（图2D）。在片仔癀处理的小鼠中，益生菌和致病菌之间发现了互斥相关性，包括L. johnsonii-A. veronii、P. xylanivorans-P. harei、L. gallinarum-P. harei和C. jejuni。综上所述，片仔癀可能逆转结直肠癌中的微生物生态失调。接着，作者研究了结直肠癌模型中富含片仔癀的益生菌P . xylanivorans和E. limosum。研究发现，P . xylanivorans和E. limosum的培养上清可以显著抑制结直肠癌细胞（DLD1和HT-29）的活力和集落形成，而对正常结肠上皮细胞（NCM460）没有影响（图2F,G），这表明富含片仔癀的益生菌在一定程度上有助于预防结直肠癌。为了弄清肠道微生物群和代谢物是否与片仔癀在结直肠癌中的化学预防作用有关，将片仔癀处理小鼠和常规小鼠的粪便样本灌胃给接受AOM/DSS处理的无菌小鼠（图2H）。与对照组相比，PHZ处理组结肠肿瘤数量和负荷显著减少（图2H）。这些数据表明，片仔癀的抗癌作用至少部分与微生物群有关。
图2 片仔癀治疗可逆转肠道微生物生态失调。（A）AOM/DSS模型中对照组和片仔癀处理后小鼠肠道微生物群的Shannon指数（α多样性）和PCoA（β多样性）。（B）Apcmin/+模型中对照组和片仔癀处理后小鼠肠道微生物群的Shannon指数（α多样性）和PCoA分析（β多样性）。α和β多样性分别采用双尾Mann-Whitney U检验和PERMANOVA检验进行比较。（C）AOM/DSS模型中对照组和片仔癀组肠道微生物组热图。使用多变量统计模型检测丰度差异（P < 0.05 （FDR校正），FC > 1.5, MaAsLin2）。（D）对照组和片仔癀组差异菌群的生态网络。相关性用SparCC法测定。选取对照组与片仔癀组相互作用强度差 > 0.7的相关性进行可视化。（E）AOM/DSS和Apcmin/+模型小鼠中，对照组和片仔癀处理小鼠中Pseudobutyrivibrio xylanivorans及Eubacterium limosum的丰度差异，T检验。（F）DLD1、HT-29和NCM460细胞与P . xylanivorans （5%）、E. limosum （15%）、E. coliP的培养上清共培养的生长曲线，空白对照，双因素方差分析，***P < 0.001。（G）DLD1、HT-29和NCM460细胞与P . xylanivorans （5%）、E. limosum （15%）、E. coliP的培养上清共培养的集落形成，空白对照、双因素方差分析。（H）AOM/DSS处理的无菌小鼠用对照-FMT和片仔癀-FMT灌胃。对照-FMT和片仔癀-FMT组中处死时的结肠（上）、肿瘤数量和肿瘤负荷（下）的代表性图像。
Result 3 片仔癀调节结直肠癌患者的肠道代谢物
鉴于肠道菌群分泌的代谢物在调节健康和疾病中发挥重要作用，作者接下来在AOM/DSS模型和Apcmin/+模型中对高剂量片仔癀治疗小鼠和对照小鼠的粪便样本进行了代谢分析。PCA和PLS-DA分析显示，在两种结直肠癌模型中，片仔癀组和对照组的代谢组群明显分离（图3A）。在AOM/DSS模型中，与对照组小鼠相比，片仔癀处理小鼠粪便中的35种代谢物显著改变（图3B）。通过LC-MS对片仔癀成分和这些代谢物并排比较发现这些代谢物中有7种来自片仔癀（图3B）。通路富集分析显示，片仔癀上调了牛磺酸和次牛磺酸代谢、胆汁酸和不饱和脂肪酸合成（图3C）。与对照Apcmin/+小鼠相比，片仔癀处理的Apcmin/+小鼠粪便中的45种代谢物显著改变。与AOM/DSS模型类似，在Apcmin/+模型中，片仔癀也上调了不饱和脂肪酸的生物合成。第一和第三条途径与片仔癀组分、牛磺酸胆酸（TCA）和胆酸（CA）有关。后一种途径是高剂量片仔癀组硬脂酸（SDA）和蓖麻油酸（RA）24,25升高的结果。为了将这些代谢物与肠道微生物的潜在代谢活动联系起来，作者对有改变的细菌和代谢物进行了综合分析。结果发现益生菌L. gallinarum与TCA呈正相关（图3D），P . xylanivorans和E. limosum与16-羟基十六烷酸和戊二酸呈正相关（图3D）。此外，P .xylanivorans、E. limosum、L. gallinarum和L. acidophilus与RA和SDA呈正相关（图3E）。此外，致病菌P. harei、C. aerofaciens、A. veronii和C. aerofaciens与RA、SDA、16-羟基十六酸呈负相关（图3D,E）。以上结果表明肠道内代谢物和微生物群可能共同促进片仔癀在结直肠癌中的化学预防作用。
图3 片仔癀改变粪便中与肠道微生物相关的代谢物。（A）AOM/DSS模型和Apcmin/+模型的主成分分析（PCOA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）结果表明，对照组和片仔癀处理后小鼠的粪便代谢谱存在显著差异。（B）AOM/DSS模型中对照组与片仔癀组代谢物差异，P < 0.05，双尾MannWhitney U检验。（C）AOM/DSS模型中对照组与片仔癀组差异代谢物的富集分析。（D）通过AOM/DSS模型的部分Spearman相关性分析片仔癀相关代谢物差异菌群的关联。（E）通过AOM/DSS模型的部分Spearman相关分析细菌与差异细菌相关代谢物的关联。
Result 4 片仔癀恢复结直肠癌患者的肠道屏障功能
肠道生态失调是肠道屏障功能障碍的重要因素。为了评估片仔癀是否会影响肠道屏障功能，作者在AOM/DSS和Apcmin/+小鼠模型中进行了FITC-葡聚糖肠通透性测试。如图4A所示，高剂量片仔癀显著降低了AOM/DSS处理小鼠和Apcmin/+小鼠血清中FITC-葡聚糖水平。作者还测试了肠道屏障完整性的另一个标志血清细菌脂多糖（LPS），结果表明其在高剂量片仔癀组中持续降低（图4A）。与此同时，片仔癀通过透射电子显微镜恢复了肠道屏障结构（图4B）。通过免疫组织化学染色，片仔癀处理小鼠的紧密连接蛋白E-cadherin和ZO-1的表达升高（图4C）。Western blot和q-PCR检测结果显示，片仔癀显著提高了E-cadherin（CDH1）、Occludin（Occludin）和ZO-1水平（图4D,E），这些发现表明片仔癀-肠道菌群轴可能有助于肠道屏障功能的恢复。
图4 片仔癀可恢复结直肠癌诱导的肠道屏障功能障碍。（A）AOM/DSS模型和Apcmin/+模型小鼠血清FITC-dextran 4KD浓度和LPS浓度。（B）对照组和片仔癀处理小鼠细胞间连接的透射电镜代表性图像。（C）免疫组织化学染色对AOM/DSS模型和Apcmin/+模型小鼠结肠组织中粘附分子E-cadherin和ZO-1的分布进行定量分析。（D）免疫印迹法测定AOM/DSS模型和Apcmin/+模型小鼠结肠组织中肠屏障相关蛋白E-cadherin、occlocclding和ZO-1的表达。（E）通过qPCR检测AOM/DSS模型和Apcmin/+模型小鼠结肠组织中肠道屏障相关蛋白CDH1、OCCLN和ZO-1的表达。统计学显著性采用T检验。
Result 5 片仔癀抑制结直肠癌的致癌和促炎信号
为了深入了解片仔癀在结直肠癌中的抑瘤作用，作者对两种结直肠癌模型的大块结肠组织进行了RNA测序。与对照组小鼠相比，片仔癀处理后小鼠中有588个基因上调，373个基因下调。KEGG富集分析显示，片仔癀处理后，PI3K-Akt信号通路下调幅度最大（图5A1,A2）。片仔癀治疗抑制了两种结直肠癌模型结肠组织中p-Akt的表达进一步印证了以上结果（图5B）。由此可见，片仔癀抑制结直肠癌中致癌PI3K-Akt信号通路。
结直肠癌患者肠道菌群失调与炎症密切相关。RNA测序结果表明，片仔癀可以抑制促炎白介素17（IL-17）信号传导、肿瘤坏死因子（TNF）信号传导、细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号传导途径（图5C）。通过小鼠炎症反应和自身免疫PCR阵列，在AOM/DSS模型中，片仔癀治疗后，21个编码细胞因子及其受体的基因一致减少（图5D）。通过qPCR证实，片仔癀处理后结肠组织中Ccl2、Cxcl2、Cxcl5、TNF-α和Il17a的mRNA下调（图5E）。此外，Elisa结果表明小鼠血清中Cxcl5和TNF-α水平降低（图5F）。综上所述，片仔癀对结直肠癌的影响是由致癌和免疫相关的信号级联介导的。
图5 片仔癀抑制结肠上皮中致癌PI3K-Akt通路和促炎通路的表达。（A）RNA测序鉴定在AOM/DSS模型（A1）和Apcmin/+模型（A2）中，片仔癀可下调致癌PI3K-Akt通路。（B）Western blot检测AOM/DSS处理小鼠和Apcmin/+小鼠结肠中p-Akt和Akt的蛋白表达。（C）通过富集分析，与Apcmin/+小鼠相比，片仔癀组炎症信号通路改变。在网络中显示了IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF和趋化因子信号通路中的差异表达基因。（D）小鼠炎症反应和自身免疫PCR阵列在AOM/DSS模型中，对照组和片仔癀组之间21个转录本的表达显著下调。（E）进行定量RT-PCR验证，确认两种结直肠癌模型中Ccl2、Cxcl2、Cxcl5、TNF-a和Il17-a等基因表达的变化。（F）Elisa法测定两种结直肠癌模型中对照组和片仔癀组小鼠血清Cxcl5和TNF-a的表达。统计学显著性采用T检验。
Result 6 片仔癀的化学预防作用涉及微生物依赖成分和独立成
虽然片仔癀可以调节肠道微生物群发挥其有益功能，但片仔癀是否对结肠细胞有直接的化学预防作用尚不清楚。因此，作者在AOM/DSS处理的小鼠中使用抗生素鸡尾酒耗尽肠道微生物群。结果表明片仔癀减少了结肠肿瘤数量和体积。同样，片仔癀在抗生素鸡尾酒处理的Apcmin/+小鼠中保持了化学预防功能。此外，片仔癀抑制了肠道微生物群缺失的AOM/DSS小鼠和Apcmin/+小鼠的结肠细胞增殖。
接下来，作者在无菌小鼠中评估了AOM/DSS诱导的结肠肿瘤的发生（图6A）。与对照组相比，无菌小鼠的结肠肿瘤发生率降低。此外，片仔癀在无菌小鼠中比在常规小鼠中具有更强的化学预防作用（图6B,C）。这表明片仔癀对结直肠癌的影响可能涉及片仔癀代谢产物对结肠组织的直接影响。为了验证这一点，作者在有无片仔癀的无菌小鼠中进行了代谢组和转录组研究。代谢组的PCA和PLS-DA分析显示，片仔癀组和对照组与AOM/DSS处理的无菌小鼠明显分离（图6D）。在271个缺失和327个富集的样本中，作者发现在片仔癀无菌处理和常规AOM/DSS模型中，16-羟基十六烯酸、胆酸、牛磺胆酸和青绿素的富集是一致的（图3B,6E）。此外，作者比较了三种模型（常规AOM/DSS、常规Apcmin/+小鼠和无菌AOM/DSS）小鼠粪便中分离的片仔癀成分和代谢物，检测到54种片仔癀成分，包括脂肪酸和胆汁酸，与对照组小鼠相比，这些成分在片仔癀处理的常规小鼠（图3B和C）和无菌小鼠（图6E）中也显著富集。
RNA测序证实片仔癀处理后无菌小鼠的炎症信号通路下调，包括IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路和趋化因子信号通路（图6F），与传统的AOM/DSS模型相似（图5C），这表明片仔癀成分可以抑制结直肠癌的炎症。同时，血清FITC-葡聚糖和LPS以及紧密连接蛋白表达的下调证明片仔癀恢复了AOM/DSS处理后无菌小鼠的肠道屏障功能（图6G）。为了阐明肠道微生物群和片仔癀修复肠道屏障功能的关系，作者将片仔癀处理后的常规小鼠的粪便分离成细菌（片仔癀bac）和代谢物（片仔癀-met）部分，然后移植到AOM/DSS处理的小鼠中（图6H）。片仔癀-bac和片仔癀-met都能部分恢复肠道屏障功能，抑制结肠肿瘤的发生（图6I，J，K，L），这意味着片仔癀相关的微生物群和代谢物都有助于片仔癀对肠道屏障功能的恢复。
图6 片仔癀的化学预防作用涉及微生物群依赖性和非微生物群依赖性。（A）无菌（GF）小鼠AOM/DSS诱导肿瘤模型的治疗示意图。（B）AOM/DSS处理的GF和常规小鼠腺瘤的结肠和H&E染色的代表性图像。（C）AOM/DSS处理的GF和常规小鼠的肿瘤数目及负荷。（D）通过PCOA和PLS-DA分析，对照组小鼠和片仔癀处理的GF小鼠之间的粪便代谢谱显著改变。（E）火山图显示对照组和片仔癀处理的GF小鼠的代谢物丰度存在差异。（F）RNA测序显示，与对照组相比，片仔癀处理的GF小鼠炎症通路下调。（G）对照组和片仔癀处理的GF小鼠血清FITC-葡聚糖4 kDa和LPS（左）。Western blot检测对照组和片仔癀处理的GF小鼠结肠组织中肠屏障相关蛋白E-cadherin、occloccling和ZO-1的表达（中）。免疫组织化学染色检测对照组和片仔癀处理的GF小鼠结肠组织中ZO1的分布（右）。（H）AOM/DSS处理小鼠片仔癀相关菌（片仔癀-bac）及代谢物（片仔癀-bac）移植实验设计。在第10周和第14周检测肠道通透性，每组n=15。（I）结肠的代表性图像（左）和不同组的肿瘤数量（右）。（J）第10周和第14周血清FITC-葡聚糖4kDa浓度。（K）不同组血清LPS水平。（L）Western blot检测肠屏障相关蛋白E-cadherin、occloccling和ZO-1在结肠组织中的表达。两组间的统计学显著性采用T检验。多组间的统计学显著性采用单因素方差分析。
Result 7 片仔癀抗癌人参皂苷对结直肠癌有直接的化学预防作用
为了探究片仔癀的活性成分，作者将片仔癀处理后小鼠的粪便样本在熟肉培养基中培养，然后分别在有氧和厌氧条件下在含片仔癀的BHI培养基中培养。接着用靶向UHPLC-QE-MS分析这些样品中的片仔癀成分（图7A），结果发现多种人参皂苷被好氧微生物下调。这表明人参皂苷可能是片仔癀的活性成分（图7B）。接下来作者探究了人参皂苷是否是介导片仔癀化学预防作用的成分。用片仔癀中发现的7种不同人参皂苷处理结直肠癌细胞（DLD1和HT-29）和正常结肠上皮细胞NCM460，结果发现人参皂苷Re（G-Re）和人参皂苷F2（G-F2）抑制DLD1和HT-29细胞的增殖（图7C），而对NCM460细胞没有影响。G-Re和G-F2抑制DLD1和HT-29细胞集落形成（图7D），并直接抑制结直肠癌细胞中的致癌和促炎信号（图7E）。此外，作者在使用和不使用G-Re和G-F2的情况下处理了来自患者的结直肠癌类器官（74、816、818和1482），结果显示G-F2和G-Re显著抑制结直肠癌类器官的生长（图7F）。值得注意的是，富含抗癌G-Re和G-F2化合物的片仔癀增强了化学预防效果。综上所述，G-Re和G-F2可以直接在结直肠癌中发挥肿瘤抑制作用。
图7 片仔癀抗癌人参皂苷对结直肠癌有直接的化学预防作用。（A）片仔癀对微生物群影响的实验设计（每组n=3）。（B）片仔癀+Abx组与片仔癀组中药非靶代谢产物差异，P < 0.05，双尾MannWhitney U检验。（C）人参皂苷Re（GRe）和人参皂苷F2（G-F2）处理后结直肠癌细胞系DLD1、HT-29和正常结肠细胞系NCM460的细胞活力。（D）G-Re和G-F2处理结直肠癌细胞系集落形成的代表性图像和集落形成实验的定量分析。（E）定量RT-PCR检测G-Re和G-F2处理DLD1和HT-29细胞中Cxcl5和TNF-α的表达。（F）G-Re和G-F2处理的结直肠癌类器官的代表性图像和计算表面积。统计学意义采用单因素方差分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。
总结与思考
本文证明了片仔癀在致癌物质诱导（AOM/DSS）和Apcmin/+两种结直肠癌小鼠模型中的化学预防作用。在这两种模型中，片仔癀剂量依赖性的降低了结肠细胞的增殖、肿瘤的多样性和负荷。最重要的是，片仔癀发挥化学预防作用的剂量是安全的且耐受性良好，这说明片仔癀对治疗结直肠癌是安全有效的。
研究表明肠道生态失调有助于结直肠肿瘤的发生，因此作者分析了片仔癀与肠道微生物群之间的关系。宏基因组分析结果显示片仔癀可调节肠道生态失调，在AOM/DSS和Apcmin/+模型中，片仔癀处理后使得抑制结直肠癌细胞生长和集落形成的益生菌P. xylanivorans、E. limosum富集。此外，在AOM/DSS模型中发现了富含片仔癀的益生菌L. acidophilus、L. gallinarum和L.johnsonii，在Apcmin/+模型中发现了L. lactis、S. thermophilus和A. muciniphila。作者先前的研究表明，L. gallinarum可产生吲哚-3-乳酸来抑制结直肠癌的发生，S.thermophilus分泌β-半乳糖苷酶来抑制结直肠癌。L.acidophilus能下调增殖标志物如β-catenin和Ki-6730，特别是与antitla-4治疗联合使用，降低了Apcmin/+小鼠的肿瘤多样性。L. johnsonii则降低了促炎介质，减轻了DSS诱导的结肠炎。此外，网络分析表明，富含片仔癀的益生菌对致病菌具有拮抗作用，包括C.jejun、P hari、A. veronii和C. aerofaciens。总的来说，片仔癀诱导的肠道微生物群改变可能有助于其在结直肠癌中发挥化学预防作用。
接下来，作者阐明了片仔癀和肠道菌群轴之间的串扰在结直肠癌预防中的作用。在片仔癀处理的小鼠中发现了大量上调的代谢物，包括片仔癀衍生的TCA和CA。综合元基因组和代谢组分析显示，TCA与L. gallinarum丰度呈正相关，而CA与P. harei和C. aerofaciens丰度呈负相关。已知共轭胆汁酸如TCA在表达胆盐水解酶的细菌中富集，包括许多乳酸菌菌株，推断片仔癀成分和富含片仔癀的益生菌之间存在积极的相互作用。除胆汁酸外，片仔癀处理后的小鼠中的脂肪酸SDA和RA的丰富也增加。RA是一种抗炎脂肪酸，在体外和体内可抑制急性和亚慢性炎症，与L. gallinarum、L. acidophilus、P. xylanivorans和E. limosum的丰度呈正相关。SDA是一种18碳长链多不饱和脂肪酸，据报道与CD95介导的细胞凋亡增加有关。
肠道屏障功能障碍，以紧密连接蛋白的缺失和紧密连接通透性增加为特征，是结直肠癌的共同特征。然而，肠道渗漏会导致微生物及其代谢物的易位，从而导致炎症。因此，作者探索了片仔癀诱导的上皮屏障功能改变及其相关的肠道微生物群变化。片仔癀处理后小鼠血清中的FD4和LPS水平降低。此外，在片仔癀治疗的小鼠中，发现根尖连接复合体和细胞旁间隙宽度变小，肠道屏障相关标志物E-cadherin、occlocclud和ZO-1的蛋白表达增加，表明肠道屏障功能得到恢复。综上表明片仔癀通过使肠道屏障功能正常化来改善肠道共生，从而抑制结直肠癌的发生。
结直肠癌相关的微生物群已被证明在结直肠癌发生过程中可引发多种炎症和致癌途径。由于片仔癀在结直肠癌模型中可以促进有益的肠道共通物和代谢物，并恢复肠道屏障功能，因此作者通过表达谱进一步研究了片仔癀抑制结直肠癌的信号机制。完整组织的RNA测序显示片仔癀抑制结直肠癌的促炎和致癌途径。片仔癀抑制促炎途径，包括IL-17、TNF、细胞因子和趋化因子信号。微阵列数据显示Il17a和Il23a显著减少，说明Th17细胞反应是片仔癀抑制的主要途径。多项研究表明Th17通路参与结直肠肿瘤发生，阻断IL17A可抑制肿瘤生长。片仔癀还降低了促炎Ccl2、Cxcl2、Cxcl5和TNF-α细胞因子的表达，这些细胞因子驱动免疫细胞趋化。片仔癀也下调了PI3K-AKT的致癌信号。这些发现表明片仔癀可抑制促炎信号通路和PI3K-Akt信号通路，从而抑制结直肠癌。
作者发现片仔癀在缺乏肠道微生物群的情况下也具有化学预防作用，推测片仔癀成分可能直接抑制结直肠癌。在AOM/DSS处理的无菌小鼠中，片仔癀抑制了促炎途径，如IL-17、TNF、细胞因子和趋化因子信号传导。同时，片仔癀中的活性化合物G-Re和G-F2能抑制结直肠癌细胞系和患者来源的结直肠癌类器官的生长，下调致癌和促炎信号，这与其他报道人参皂苷抗癌作用的研究一致。此外，在片仔癀中添加G-Re和G-F2可提高片仔癀的体内疗效。综上所述，片仔癀在结直肠癌中的化学预防作用涉及改变的肠道微生物群和代谢物。
总之，本文首次证明了片仔癀在结直肠癌体内的化学预防作用。片仔癀调节肠道微生物组成，促进保护性代谢物的分泌，改善肠道屏障功能，抑制致癌和促炎途径。本文为片仔癀与肠道微生物群之间复杂的相互作用提供了见解，并为利用片仔癀预防结直肠癌的未来策略提供了信息。
原文链接：
https://doi.org/10.1053/j.gastro.2023.08.052IF: 29.4 Q1
DOI：10.1053/j.gastro.2023.08.05
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