导读
糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见、最严重的并发症之一，目前缺乏有效的治疗方法。丹参是治疗DN的关键中药之一。丹酚酸B和丹参酮IIA是丹参中含量高并且结构明确的两种单体活性成分，可有效改善早期DN。本研究评价丹酚酸B和丹参酮IIA对早期DN大鼠的配伍作用，并阐明其作用机制。本研究采用链脲佐菌素（STZ）联合高糖高脂饮食诱导早期DN大鼠，丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合对其进行干预。我们对肾、肝的病理切片及生化指标进行分析；采用网络药理学方法预测其可能的作用机制；通过代谢组学、酶联免疫法和蛋白质印迹阐明了其机制。根据我们的分析，丹酚酸B和丹参酮IIA可以协同调节24 h尿蛋白(UTP)、尿素和肌酐(Scr)，并改善早期DN大鼠的肾损伤。早期DN大鼠的代谢异常通过调节饱和脂肪酸的生物合成、甘油磷脂代谢、类固醇生物合成、丙氨酸和花生四烯酸得到改善。丹酚酸B与丹参酮IIA以13.4:1的质量比联合使用，可显著减轻肾脏炎症，上调p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt，下调p-NF-κB/NF-κB，优于单用组，可被PI3K抑制剂LY294002逆转。丹酚酸B和丹参酮IIA可协同改善早期DN大鼠的糖脂紊乱、肝肾损伤和抵抗肾脏炎症，其机制可能与调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路有关。
亮点：
1.丹酚酸B和丹参酮IIA可协同改善早期DN；
2.丹酚酸B联合丹参酮IIA可改善早期DN大鼠的代谢异常；
3. 丹酚酸B和丹参酮IIA协同调节PI3K/Akt/NF-κB通路。
论文ID
原名：Salvianolic acid B and tanshinone IIA synergistically improve early diabetic nephropathy through regulating PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway
译名：丹酚酸B和丹参酮IIA通过调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路协同改善早期糖尿病肾病
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.10
通讯作者：段金廒，宿树兰
通讯作者单位：南京中医药大学
实验设计
实验结果
1. 动物状态，体重，空腹血糖（FBG）和器官指数
成功建模后，大鼠逐渐出现皮毛发黄、精神状态不佳、逐渐死亡，并伴有明显的多饮、多食、多尿，体重显著减轻，FBG显著升高（图1A）。共有41只大鼠死亡，死亡率为37.27%。与对照组相比，模型组的最终FBG显著增加，最终体重显著降低（P<0.001），表明糖尿病大鼠成功建立。与模型组相比，不同给药组对FBG有不同程度的调节作用。阳性药（PD）组、丹酚酸B（SB）组、丹参酮IIA（TA1）组、低剂量组合1（Comb1L）组、高剂量组合1加LY294002（Comb1+LY）组和高剂量组合1（Comb1H）组均有显著的缓解作用（P<0.05）。器官指数结果（图1B）显示，与对照组相比，模型组的心、肝、肾、肺指标显著升高（P<0.05）。与模型组相比， TA1、低剂量组合2（Comb2L）、高剂量组合2（Comb2H）和高剂量组合2+LY294002（Comb2+LY）组具有显著的回调效应（P<0.05）。
表1 大鼠的分组和治疗
图1 （A）SD大鼠血糖和体重的变化；（B）SD大鼠器官指数。（n≥6，平均值±SD。模型组与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；模型组与给药组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001：）。
图2 各组大鼠的甘油三酯（TG）、总胆固醇（TCH）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白、24小时尿蛋白（UTP）、尿素氮（尿素）、血清肌酐（Scr）和尿肌酐（UCR）。（n≥6，平均值±标准差。#P<0.05，###P<0.01，###P<0.001：模型组与正常组比较；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001：模型组与给药组比较）。
2. 生化指标
如图2所示，与对照组相比，模型组TG、TCH、UTP、尿素和Scr显著升高（P<0.05），HDL和Ucr显著降低（P＜0.05），说明DN模型建立成功。SB和TA1中24 h UTP的下调与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），而在Comb1L和Comb1H中更为显著（P＜0.001）。与模型组相比，SB和TA1中尿素和Scr的下调不显著（P>0.05），而Comb1L中尿素和Scr的下调显著（P<0.05）。SB和TA1对尿素和Scr的调节与模型组比较无显著性差异（P>0.05），Comb1L组有显著性差异（P＜0.05）。与模型组相比，SB中的尿素和HDL以及TA1中的HDL的调节不显著（P>0.05），而Comb2L中的调节显著（P<0.05）。
图3 大鼠肾脏组织病理切片（×200，HE染色）。（黄色箭头：嗜酸性液滴出现在肾小管的管腔中，橙色箭头：管状扩张/上皮扁平化/不规则管腔，绿色箭头：肾小球血管充血/间质毛细血管充血，黑色箭头：肾包膜扩张）。
3. 组织病理学
如图3所示，肾小管管腔内的嗜酸性粒细胞液滴、肾小管扩张、管腔不规则、上皮细胞扁平化以及间质血管和毛细血管外渗在模型组肾脏中更为常见，这表明早期DN大鼠模型的成功。所有给药组均有不同程度的缓解，其中PD、Comb1L和Comb1H组的病理变化相对较少。
图4 （A）丹酚酸B和丹参酮IIA靶点和早期DN靶点的维恩图；（B）丹酚酸B和丹参酮IIA治疗早期DN的潜在靶点的相互作用网络（圆圈表示基因，程度越大，圆圈越大，颜色越深（红色）；组合得分越大，线条越粗，颜色越浅（蓝色））；（C）丹酚酸B治疗早期DN的GO和KEGG靶点富集分析（前20名）；（D）丹参酮IIA治疗早期DN的GO和KEGG靶点富集分析（前20位）。
4. 丹酚酸B和丹参酮IIA与早期DN靶点的维恩图
GeneCards和OMIM数据库共确定了3475个与早期DN相关的靶点。我们通过SwissStarget平台分别鉴定了98个与丹酚酸B和和111个与丹参酮IIA相关的靶点。丹酚酸B和早期DN共有61个共同靶点，丹参酮IIA和早期DN有50个共同靶点（图4A）。
表2 丹酚酸B和丹参酮IIA治疗早期DN的共同途径
图5 大鼠肾脏中炎症因子（A）（n≥6）和蛋白质（B）的表达（n≥3）。（平均值±标准差。#P<0.05，###P<0.01，###P<0.001：模型组与正常组比较；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001：模型组与给药组比较）。
5. PPI网络构建与分析
STRING数据库的结果显示，丹酚酸B和早期DN的PPI网络图共有61个节点和311条边，丹参酮IIA和早期DN共有50个节点和208条边。Cytoscape 3.6.0软件用于绘制共同靶点的相互作用网络，如图4B所示。筛选程度≥20的靶点，如表S1所示。表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、AKT等蛋白相互作用频率高，靶位点间相互作用强，程度高，尤其是EGFR基因，提示这些靶点可能是丹酚酸B和丹参酮IIA治疗早期DN的潜在核心靶点。
6. GO和KEGG富集分析
我们通过GO和KEGG富集分析分析丹酚酸B和早期DN的共同靶点（图4C），获得了140个生物过程（BP），主要与脂蛋白代谢、低密度脂蛋白颗粒受体生物合成过程和血小板衍生生长因子受体信号转导途径有关。结果共获得37种细胞成分，主要与丝氨酸肽酶复合物和质膜有关；获得了50个分子功能（MF），主要与C-X3-C趋化因子结合外肽酶活性、半胱氨酸型内肽酶活性等功能有关，如图4所示。KEGG富集获得55条信号通路，主要涵盖ECM受体相互作用和PI3K-Akt信号通路。
我们通过GO和KEGG富集分析分析丹参酮IIA和早期DN的共同靶点（图4D），获得140个生物过程（BP），主要与突触传递的负调控和造血干细胞迁移的正调控有关；共获得31个CC，主要与E1-CDK2复合体、核包膜腔、非对称性突触等有关；获得39个MF，主要与食欲素受体活性、乙酰胆碱酯酶活性和胆碱酯酶活性有关。KEGG富集得到35条信号通路，主要包括Rap1信号通路、FoxO信号通路和PI3K-Akt信号通路。
丹酚酸B和丹参酮IIA信号通路的交叉揭示了36种共同通路，包括PI3K-Akt信号通路，如表2所示。
图6 C组（绿色）和M组（蓝色）偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）的得分图（A：血清，C：尿液）；C组和M组的S图分析得分图（B：血清；D：尿液）。
7. 肾炎性因子
基于网络药理学的结果和先前的结果，我们选择PI3K/Akt/NF-κB信号通路介导的炎症反应进行进一步研究。如图5A所示，与对照组相比，模型组肾脏中IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α水平显著升高（P<0.05），而PD、Comb1L、Comb1H和Comb2H组IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α均显著下调（P<0.05），而Comb2L组IL-6和IL-1β及TNF-α则显著下调（P<0.01）。与Comb1H和Comb2H组相比，Comb1H+LY和Comb2H+LY组表现出上调的趋势，尤其是在IL-6和TNF-α的调节方面。
表3 血清和尿液中潜在生物标志物的鉴定
注:↑表示模型组增加，↓表示模型组减少。
8. 肾组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-NF-κB/NF-κB的表达
与对照组相比，模型组肾脏p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值显著降低（p<0.01），p-NF-κB/NF-κB比值显著升高（p<0.05）。与模型组相比，Comb1L组具有最显著的调节作用（P<0.05），且优于SB组和TA1组。与Comb1H组相比，Comb1+LY组在p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB方面倾向于逆转Comb1H的疗效（图5B）。
图7 给药组对血清（A）和尿液（B）中潜在差异代谢产物的调节。（n≥6，平均值±标准差。#P<0.05，###P<0.01，###P<0.001：模型组与正常组比较；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001：模型组与给药组）。
9. 尿液和血清代谢组学
我们将对照组和模型组的血清和尿液代谢组学数据导入SIMCA P 14.1软件，并进行PLS-DA和OPLS-DA分析（图6）。根据OPLS-DA评分图，对照组和模型组的血浆和尿液样本在正离子和负离子模式下有明显差异，表明早期DN大鼠出现代谢异常。代谢组学分析在早期DN大鼠血清中共发现24种不同的代谢产物，其中18种差异代谢产物可由给药组调节。在早期DN大鼠的尿液中共发现23种差异代谢产物，给药组可调节13种差异代谢物质（表3和图7）。与模型组相比，Comb1L和Comb1H组对早期DN大鼠血清LysoPC（16:0/0:0）、LysoPC和N-stearoyl Glutamic acid有显著的降低作用。Comb2L和Comb2H组对血清LysoPC（16:0/0:0）、Cer（D18:0/16:0）、LysoPC、N-stearoyl Glutamic acid和TG（15:0/20:18:4（6Z，9Z，12Z，15Z）均有显著的回调作用（P<0.05）。TA1、Comb1L、Comb2L和Comb2H组对早期DN大鼠尿中2,3-Dinor-TXB2有明显的回调作用（P<0.05）。
与对照组相比，早期DN大鼠血清中不饱和脂肪酸的生物合成途径、甘油磷脂代谢、类固醇生物合成、类固醇激素生物合成和花生四烯酸代谢，尿液中的花生四烯酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成和其他代谢途径发生了改变（图8A和C）。丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合可调节早期DN大鼠血清中不饱和脂肪酸的生物合成、甘油磷脂代谢、类固醇生物合成和花生四烯酸代谢，以及尿液中的泛酸、辅酶a生物合成、β-丙氨酸代谢、半乳糖代谢、不饱和脂肪酸生物合成和嘌呤代谢代谢、酪氨酸代谢、甘油、花生四烯酸代谢、丙氨酸，谷氨酸和天冬氨酸代谢、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成途径（图8B&D）。
图8 糖尿病肾病大鼠尿液（A）和血清（C）中差异代谢产物的代谢途径，丹参酮B和丹参酮IIA及其组合调节的尿液（B）和血清中（D）差异代谢物的代谢途径。（a）泛酸和辅酶A生物合成，（b）β-丙氨酸代谢，（c）半乳糖代谢，（d）不饱和脂肪酸生物合成，（e）嘌呤代谢，（f）类固醇激素生物合成，（g）精氨酸和脯氨酸代谢，（h）甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，（i）酪氨酸代谢，（j）甘油脂质代谢，（k）花生四烯酸代谢，（l）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，（m）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，（n）类固醇生物合成。
讨论
糖尿病是一种以血糖水平升高为特征的慢性代谢性疾病，约三分之一的患者会并发肾损伤。尿蛋白已被认为是评估和监测肾功能的标志物。本实验采用STZ联合高糖高脂饮食4周诱导大鼠早期DN。与对照组相比，模型组FBG、TG、TCH、UTP、尿素和Scr显著升高，肾小管和肾小球病变，表明早期DN大鼠发生了糖脂紊乱和肾损伤。给药后，生化指标和病理变化均有不同程度的改善，表明丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合均能有效改善早期DN大鼠糖脂代谢异常和肾损伤。Comb1L组的回调效果最为显著，优于相应的SB组和TA1组，尤其是对24 h UTP、尿素和Scr，提示丹酚酸B和丹参酮IIA可协同改善早期DN大鼠的肾脏损伤。
在本研究中，EGFR、MMP9、CASP3、AKT1和PTGS2（前列腺素内环氧化物合酶2）具有频繁的蛋白质相互作用。EGFR是一种血管内皮生长因子受体，可调节和维持正常肾小球的过滤功能，改善早期DN。MMP-9是锌依赖性内肽酶家族的成员，它在细胞外基质（ECM）的合成和降解之间提供稳态，并维持肾小球的结构和功能完整性。CASP3是与细胞凋亡功能相关的蛋白酶之一，其激活是不可逆细胞凋亡的标志。一项研究表明，糖尿病大鼠足细胞中CASP3的表达显著增加。Akt是细胞内信号系统中的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，激活Akt可导致细胞外基质沉积，导致肾纤维化。Shi Mingjun发现，Akt1在糖尿病大鼠的肾组织中过表达，并在整个疾病过程中持续过表达。PTGS2作为一种重要的炎症介质，参与了从炎症初期到形成的全过程，其过表达可破坏内部环境的平衡。通过交叉丹酚酸B和丹参酮IIA在早期DN治疗中可能参与的途径，我们发现丹酚酸和丹参酮II A联合处理可能会干扰PI3K/Akt信号通路。
临床研究表明，DN患者的血清中主要存在氨基酸代谢、脂肪酸代谢和血浆磷脂代谢，尿液中主要存在色氨酸代谢和线粒体代谢，其结果与我们相似。皮质醇是一种糖皮质激素，被公认为对葡萄糖代谢有害。一项临床研究表明，夜间皮质醇水平升高可能是DN的一个危险因素。我们发现早期DN大鼠的血清皮质醇显著升高，而给药组没有调节作用，提示丹酚酸B和丹参酮IIA可能不通过糖皮质激素途径改善DN。Pin Gong认为早期DN大鼠血清花生四烯酸显著升高，花生四烯酸被认为是一种潜在的生物标志物。我们的研究结果表明，早期DN大鼠血清和尿液中的花生四烯酸均显著增加。花生四烯酸代谢途径是丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合改善早期DN大鼠DN的重要和主要代谢途径之一。花生四烯酸（AA）通过酶和非酶机制产生具有生物活性的含氧分子参与DN的发生发展，包括来源于环氧合酶（COX）的血栓素A2（TXA2）和来源于脂氧合酶的羟基二十碳烯酸（HETE）。AA可通过细胞色素P450羟化酶代谢产生炎症性20-HETE。20-HETE具有促血管生成、促纤维化和促炎症的特性，可能导致高血压和肾损伤。同时，20-HETE水平升高可通过cAMP/PKA途径诱导高血糖。这可能是本研究中早期DN大鼠尿液中20-HETE水平显著升高的原因。研究表明，COX激活TXA2受体有助于DN的发展。TXA2是除肾小球高血压、晚期糖基化终产物和多元醇途径外导致肾病的另一个因素。在糖尿病中，血小板聚集增多，TXA2从肾小球血栓形成中释放，并在血清和尿液中快速非酶代谢为TXB2。血清TXB2很容易被酶代谢为2,3-Dinor-TXB2并通过尿液排出。因此，尿液中2,3-Dinor-TXB2的量可能主要反映血小板释放的TXA2的量。早期DN大鼠尿中2，3-Dinor-TXB2含量显著升高，而PD、TA1、Comb1L、Comb2H和Comb1+LY组均具有显著的回调作用，提示丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合可能通过抑制TXA2的合成来改善DN。
Cox衍生的前列腺素E2和TXA2是激活NF-κB的关键促炎代谢产物，NF-κB的激活可以调节炎症细胞因子、趋化因子和粘附分子如MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α的表达，从而引发炎症。促炎细胞因子是DN发展和进展的关键介质。与健康动物相比，DN动物肾脏中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著上调，这与我们的结果一致。研究表明，TNF-α对肾小球系膜和上皮细胞具有细胞毒性，可直接导致肾损伤，而IL-1β水平与血管内皮细胞通透性增加有关。肿瘤坏死因子（TNF）是一种强效的促炎细胞因子，也是炎症组织损伤的重要介质。其他研究表明，IL-1β和TNF-α是DN小鼠肾小球系膜细胞中钙调磷酸酶1亚型4的诱导物，从而激活钙调磷酸酶在肾小球肥大和ECM积累中发挥作用。早期研究报道，在STZ诱导的DN大鼠中，肾脏TNF和尿液TNF的表达水平增加甚至早于蛋白尿的发生。DN和MCP-1似乎是一种相互作用的关系。一方面，高糖或晚期糖基化终产物可以独立刺激人系膜细胞中MCP-1的表达和分泌。另一方面，MCP-1不仅可以通过单核细胞/巨噬细胞的募集和激活来促进DN的发展，还可以直接增加DN中细胞外基质（ECM）的积累。人类研究表明，DN患者的血清IL-6水平高于非DN患者，携带IL-6基因多态性的2型糖尿病患者患DN的风险更大。Il-6通过调节系膜细胞和肾小管细胞的炎症和足细胞肥大参与DN的进展。与模型组相比，Comb1L和Comb1H组可显著下调IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α，且优于SB和TA1组，表明丹酚酸B和丹参酮IIA可协同抑制早期DN大鼠的肾脏炎症。Comb1L组可显著下调MCP-1，而Comb2L组无明显作用，提示不同比例的丹酚酸B和丹参酮IIA可能具有不同的抗炎作用机制。丹酚酸B和丹参酮IIA的配伍比例与抗炎机制之间的关系还需要更多的实验来探索。
研究表明，异常的PI3K/Akt信号通路参与了DN肾损伤的病理过程，它主要通过调节GSK-3β、NF-κB和mTOR等来改善DN患者的肾脏炎症。其中，GSK-3β是糖原合成和细胞葡萄糖摄取的关键调节激酶，主要参与葡萄糖代谢过程，而mTOR主要参与自噬和氧化应激的调节。NF-κB可以促进炎症因子的转录，导致炎症反应的发生，被认为是改善炎症的重要靶点。然而，PI3K/Akt信号通路与NF-κB在抗炎过程中的关系仍然没有定论，相反的结论经常被报道。据报道，KK-Ay糖尿病小鼠和STZ诱导的DN大鼠存在相同的现象：PI3K/Akt信号通路下调和p-NF-κB/NF-κB的上调，提示PI3K/Akt介导的NF-κB信号通路可能是改善DN炎症的机制。研究表明，抑制PI3K/AKT/NF-κB/IL-1β/TNF-α信号介导的免疫炎症系统失衡是降低血糖升高、抑制肾脏炎症和ECM蛋白产生以改善DN的有效途径。一项综述表明，丹参水提取物可以降低肾脏中单核巨噬细胞抗原-1（ED-1）的表达，这反映了单核/巨噬细胞向肾小球的浸润。丹参注射液可降低糖尿病患者肾脏p-NF-κB的表达及IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。我们的研究表明，与对照组相比，模型组肾脏中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值显著降低，而p-NF-κB/NF-κB的比值显著增加。在给药组中Comb1L组的回调效果最为显著，优于SB和TA1组，提示丹酚酸B和丹参酮IIA以13.4:1的质量比协同激活早期DN大鼠肾脏PI3K/Akt，下调p-NF-κB/NF-κB。LY294002是一种PI3K抑制剂。与Comb1H组相比，Comb1+LY组倾向于逆转p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的作用，提示PI3K/Akt/NF-κB是丹酚酸B和丹参酮IIA改善早期DN大鼠肾脏炎症的途径之一。
在这项研究中，我们通过网络药理学预测了丹酚酸B和丹参酮IIA及其组合治疗早期DN的靶点和途径，但只有PI3K/AKT信号通路得到了验证，其他高度相关的途径有待未来验证。此外，本研究还采用非靶向代谢组学方法初步研究了丹酚酸B和丹参酮IIA及其组合对抗早期DN的机制，但缺乏实验验证。今后，应建立动物实验来验证丹酚酸B和丹参酮IIA及其组合的作用机制。
图9 丹酚酸B和丹参酮IIA通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路协同改善DN大鼠肾脏炎症
结论
总之，我们的研究发现，丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合可以通过不饱和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢、类固醇生物合成、丙氨酸和花生四烯酸改善早期DN大鼠的糖脂代谢异常和肝肾损伤，改善尿和血清代谢紊乱。丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合可以减轻肾脏炎症，尤其是在13.4:1的质量比下，具有协同抗炎作用，其机制可能与PI3K/Akt/NF-κB信号通路有关（图9）。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37890803/
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