导读
隐丹参酮(Cryptotanshinone，CPT)是从丹参中提取的一种重要的生物活性成分，具有多种药理活性。然而，CPT对放射性肺纤维化(RILF)的影响尚不清楚。本研究从肠-肺轴角度探讨了CPT对RILF的保护作用，特别关注了胆汁酸(BA)-肠道微生物轴。结果发现，CPT可以抑制上皮-间充质转化(EMT)过程，抑制炎症，减少辐射诱导小鼠肺纤维化的细胞外基质沉积。此外，16S rDNA基因测序和BAs靶向代谢组学分析表明，CPT可以改善RILF小鼠肠道菌群失调和BA代谢。CPT显著提高了有益菌属Enterorhabduus和Akkermansia的比例，降低了Erysipelatoclostridium的比例，这与肠道内脱氧胆酸、石胆酸等几种法尼醇X受体(FXR)天然激动剂水平升高有关，激活了FXR通路。综上所述，CPT可以调节辐射引起的小鼠肠道微生物群和BAs代谢的破坏，减轻辐射引起的肺部炎症和纤维化。因此，CPT可能是治疗RILF有希望的候选药物。
论文ID
原名：Cryptotanshinone alleviates radiation-induced lung fibrosis via modulation of gut microbiota andbile acid metabolism
译名：隐丹参酮通过调节肠道菌群和胆汁酸代谢减轻辐射引起的肺纤维化
期刊：Phytotherapy Research
IF：7.2
发表时间：2023.7
通讯作者：张卫东，祖先鹏，王淑美
通讯作者单位：海军军医大学药学院；广东药科大学药学院
DOI号：10.1002/ptr.7926
实验设计
结果
1.CPT减轻RILF小鼠的组织破坏
肺功能进行性丧失和肺组织重塑被认为是肺纤维化的特征。为了验证CPT对RILF组织学改变的影响，小鼠接受25 Gy全胸辐射，然后接受低/高剂量CPT治疗12周(图1a)。PFD是一种多细胞因子抑制剂，可防止RIPF患者肺功能下降，作为阳性对照。照射后小鼠体重明显下降，第4周CPT组小鼠体重有所改善(图1b)。照射后12周，收集肺标本，进行H&E和Masson染色。H&E染色结果显示，辐射照射后肺组织结构破坏严重，肺泡萎缩，肺泡壁增厚，大量炎症细胞浸润(图1c)。与对照组相比，辐射组马松Masson染色观察到大量蓝色胶原纤维。采用H&E染色的HE评分和Masson染色的Ashcroft评分评估肺损伤和纤维化程度。HE评分和Ashcroft评分显示，CPT(30和60
mg/kg)剂量依赖性地通过减轻炎症和抑制胶原沉积减轻辐射引起的肺组织破坏(图1d，e)。此外，CPT治疗后肺组织中HYP含量明显降低。总之，CPT在60mg
/kg剂量下的抗纤维化能力可与PFD在100mg /kg剂量下的抗纤维化能力相当。
图1 实验设计与小鼠体重、肺组织分析和羟脯氨酸(HYP)含量。(a)雌性C57BL/6小鼠分为对照组、辐射组(IR)、低剂量CPT组(CPT-L)、高剂量CPT组(CPT-H)和吡非尼酮组(PFD)，分别给予不同的处理，12周后处死小鼠采集样本；(b)各组体重变化情况；(c)肺组织切片具有代表性的H&E染色和Masson染色图像；(d)各组HE染色评分；(e)各组Ashcroft评分；(f)肺组织中HYP的含量。数据以平均值±SEM (n = 5)表示。与对照组相比，**p < 0.01；与IR组相比，#p < 0.05，##p < 0.01。
2.CPT抑制RILF小鼠的EMT过程
EMT在RILF过程中起着至关重要的作用。肺泡上皮细胞受到辐射损伤后，TGF-β1诱导EMT过程，TGF-β1是强效纤维化的关键因子。在这个转变过程中，肺泡上皮细胞失去上皮标志物，获得间充质标志物，转变为成纤维细胞或肌成纤维细胞，促进ECM，如I型胶原，导致纤维化。本研究证明了辐照后血清中TGF-β1水平升高(图2a)，CPT治疗部分逆转了这种作用。Western blot分析结果显示，与对照组相比，IR组α-SMA和vimentin两种间充质标志物上调，上皮标志物E-cadherin表达下调。免疫组化分析结果也显示，IR组小鼠I型胶原和α-SMA表达明显升高(图2e)。此外，CPT治疗恢复了I型胶原、α-SMA和E-cadherin的表达水平。以上结果表明，CPT能有效抑制EMT的发生。
图2 隐丹参酮(CPT)抑制辐射诱导肺纤维化(RILF)小鼠上皮-间充质转化过程。(a)血清中TGF-β1水平(n=5)；肺组织中(b)α-SMA、(c) Vimentin、(d) E-cadherin蛋白表达水平(n=4)；(e)肺组织中I型胶原、α-SMA免疫组化染色代表性结果及面积比(n=3)。数据以平均值±SEM表示。与对照组相比，*p < 0.05，**p < 0.01；与IR组相比，#p < 0.05，##p < 0.01。
3.CPT抑制RILF小鼠的炎症
反复的炎症是纤维化的重要触发因素，并且几乎持续整个纤维化过程。为检测CPT对RILF的抗炎作用，采用ELISA法检测各组肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平。如图3所示，CPT治疗后，IR组升高的TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低。CPT-H组的抑制效果优于CPT-L组，可与PFD组相媲美。这些结果清楚地表明CPT可以通过抑制炎症来消除RILF。
图3 隐丹参酮(CPT)抑制肺组织中炎症细胞因子水平。ELISA试剂盒测定肺组织中(a) TNF-α、(b) IL-1β、(c) IL-6水平。数据以平均值±SEM表示。与对照组相比，**p < 0.01；与IR组相比，##p < 0.01。
4.CPT可减轻RILF小鼠结肠损伤，恢复肠道屏障功能
肠道是人体最大的免疫器官。肠黏膜屏障能有效阻止肠道内细菌、毒素等有害物质进入其他组织以保护宿主免受侵袭，肠黏膜层主要由杯状细胞和紧密连接蛋白如ZO-1、occludin等组成。H&E染色结果显示，RILF小鼠出现结肠损伤，包括广泛可见的黏膜上皮变性，胞浆松弛，固有层淋巴细胞点状浸润(图4a)。免疫组织化学染色进一步显示，ZO-1和occludin蛋白定位于健康肠道上皮细胞膜，但在IR组小鼠中明显减少，这表明RILF可能导致肠黏膜屏障受损。而CPT(60 mg/kg)治疗可通过上调ZO-1和occludin的表达水平，恢复肠道屏障功能，减轻结肠损伤。
图4 隐丹参酮(CPT)可减轻小鼠结肠损伤，恢复肠道屏障功能。(a)结肠组织切片H&E染色的代表性图像。比例尺：200 μm。(b)结肠组织ZO-1、occludin免疫组化染色的代表性结果及其面积比。数据以平均值±SEM表示(n = 3)。与对照组相比，*p < 0.05，**p < 0.01；与IR组相比，#p < 0.05。
5.CPT调节RILF小鼠肠道菌群结构
采用16S rDNA测序技术测定肠道菌群组成，稀疏曲线趋于平坦，说明样本数量充足(图5a)。用α多样性和β多样性评估辐射和CPT治疗对肠道微生物群的影响。与对照组相比，IR组Sobs、Chao1、Ace指数均降低(图5b-d)。然而，CPT(60 mg/kg)处理显著增加了肠道微生物的多样性和丰富度。基于Unweighted_unifrac距离的主坐标分析(PCoA)也显示，三组肠道菌群明显分离(图5e)。
在科水平上，与对照组相比，IR组中Peptococcaceae、Lachnospiraceae、Desulfovibrionaceae、Eggerthellaceae和Anaerovoracaceae的相对丰度降低，与辐射损伤相关的Erysipelatoclostridiaceae的相对丰度升高。CPT治疗部分恢复了这些效果(图6a)。在属水平上，RILF小鼠norank_f_peptococcaceae、unclassified_f_lachnospiraceae、Lachnoclostridium、Desulfovibrio、Enterorhabdus、和Eubacterium_brachy_group的相对丰度呈下降趋势，而Erysipelatoclostridium的相对丰度增加(图6b)。有趣的是，CPT治疗不仅在属水平上恢复了肠道微生物群的失调，而且还增加了阿克曼氏菌属(Akkermansia)的丰度，Akkermansia是一种未受RILF小鼠影响的属，已被证明可以减少辐射引起的肠道损伤。
此外，作者利用LEfSe分析估计了各组从门到属的核心细菌(图7)。通过秩和检验共筛选出56个组间差异显著的属。这些结果表明，CPT对RILF的疗效可能取决于其对肠道微生物群的调节。
图5 隐丹参酮(CPT)对小鼠肠道菌群α多样性和β多样性的影响。(a)肠道菌群稀疏曲线；(b) Sobs指数；(c) Chao1指数；(d) OTU水平Ace指数；(e)基于Unweighted_unifrac距离的主坐标分析。
图6 隐丹参酮(CPT)对肠道菌群组成的影响。(a)科水平肠道菌群的相对丰度和三组显著改变菌群的相对丰度；(b)属水平肠道菌群的相对丰度和三组显著改变菌群的相对丰度。
图7 基于16S rDNA相对丰度的肠道菌群组成线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)分析。(a) LEfSe分析的LDA区分结果表。只显示LDA得分大于3的分类群；(b) LEfSe分析的物种分类学分枝图(Cladogram)。
6.在RILF小鼠中，CPT改善BAs代谢障碍并激活FXR信号
BAs作为宿主代谢的重要参与者，不仅调节肠道内稳态，而且在肠道黏膜屏障中起着至关重要的作用，阻止病原抗原的侵袭。许多研究表明，肠道生态失调和BAs紊乱会损害肠道屏障和免疫力。为了分析CPT治疗如何影响BA代谢，我们使用QTRAP 6500+ LC-MS/MS系统共鉴定了27个BAs水平。与对照组相比，IR组BAs池发生了显著变化(图8a,b)，表明RILF诱导了BAs代谢紊乱。有趣的是，通过CPT (60 mg/kg)处理，总BAs、结合型BAs、非结合型BAs、初级BAs和次级BAs的水平在很大程度上得到了恢复(图8c)。此外，CPT还显著降低了FXR拮抗剂(牛磺-β-鼠胆酸(T-β-MCA))和天然激动剂(脱氧胆酸(DCA)、牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)、石胆酸(LCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、胆酸(CA)和牛磺胆酸(TCA))的比例(图8d)。该结果表明CPT调控BA稳态，这可能与FXR的激活有关。
为了确定RILF期间粪便BAs水平的变化是否与肠道生态失调密切相关，进行了粪便BAs与肠道菌属之间的Spearman相关分析。几个属的丰度与不同BAs的相关性不同(图8e)。令人惊讶的是，作者发现DCA和LCA的水平与norank_f_ peptococcaceae、unclassified_f_ lachnospiraceae、Lachnoclostridium、Desulfovibrio、Enterorhabdus、Eubacterium_brachy_group和Akkermansia的丰度呈正相关。这些属在CPT组均有富集，而在IR组均有缺失。Enterorhabduus是参与产生胆盐脱氢酶和BAs去结合的主要细菌属，通过7α-去羟基作用将非结合型初级BA(如CA和CDCA)转化为次级BA(如DCA和LCA)。此外，IR组核心细菌Erysipelatoclostridium丰度与DCA和LCA水平呈负相关。
FXR受体作为BA传感器，在维持BA稳态中起着重要作用。FXR受体在肺中也有表达，与呼吸系统疾病有内在关系。由于CPT给药期间DCA和LCA水平明显升高，我们接下来探讨CPT对肺组织FXR受体的影响。结果表明，CPT治疗上调了FXR的蛋白表达(图8f，g)，表明FXR的激活可能是CPT通过改善BA代谢紊乱来治疗RILF的关键。
图8 隐丹参酮(CPT)通过改善胆汁酸(BAs)代谢障碍和激活FXR信号来缓解RILF。(a)非结合型BAs水平(n = 5)；(b)结合型BAs水平(n = 5)；(c)总BAs水平(n = 5)；(d) FXR拮抗剂(T-β-MCA)和天然激动剂(DCA、TDCA、LCA、TLCA、CDCA、TCDCA、CA和TCA)的比例(n = 5)；(e)显示BAs与肠道微生物群相关性的热图。红色星号表示显著正相关，蓝色表示负相关。(f) Western blotting分析肺样品中FXR的蛋白表达(n = 4)。(g)免疫组化染色的代表性结果和肺组织中FXR的面积比(n = 3)。
讨论
RILF是胸部放射治疗的潜在并发症，具有进行性、不可逆性，严重危及患者生命。迄今为止，仍没有治疗RILF的有效方法。PFD是一种多细胞因子抑制剂，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗肺纤维化。但存在胃肠道副作用、肝毒性、光敏性等严重不良反应，且口服剂量相当大。因此迫切需要寻找新的治疗RILF的药物。中药以其多靶点、副作用小等优势，在漫长的历史长河中挽救了无数生命，维护了人类健康，特别是在COVID-19全球大流行中，可能是寻找RILF新治疗药物的宝库。丹参，被用来治疗多种疾病。CPT是从丹参中提取的一种重要的生物活性成分，已被证实具有多种药理作用，包括抗癌、抗炎、免疫调节和抗纤维化活性。为了探讨CPT对RILF的作用，我们建立了C57BL/6小鼠RILF模型，H&E和Masson染色表明RILF小鼠建模成功。本研究发现，CPT治疗降低肺泡厚度，保护肺泡完整性，减轻胶原堆积，并显著降低几种促纤维化标志物的水平，包括HYP和TGF-β1。CPT组肺组织上皮标志物(E-cadherin)升高，间充质标志物(α-SMA、vimentin、collagen-I)和炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)降低，表明CPT能抑制RILF小鼠EMT过程和炎症反应。这些证据表明CPT对RILF有潜在的治疗价值。
人体肠道中生活着10万亿个细菌，这些微生物群在人体健康、机体代谢和免疫系统功能中起着至关重要的作用。新出现的实验和流行病学证据强调了肠道微生物群和肺部之间的重要相互作用，称为“肠-肺轴”。大量临床病例表明，呼吸道疾病患者常伴有胃肠道疾病。在本研究中，H&E染色和免疫组化显示，RILF小鼠出现结肠损伤和肠黏膜屏障损伤，这表明RILF中肠道和肺之间存在重要关联。而CPT可上调ZO-1和occludin的表达水平，恢复肠道屏障功能，减轻结肠损伤。此外，某些类型的细菌可以通过增加血细胞生成和胃肠道修复的速度来保护小鼠免受有害辐射。BAs作为一种有效的信号分子，与肠道菌群有着复杂的相互作用。一方面，肠道菌群参与BAs的合成、生物转化和代谢。另一方面，BAs通过肠道屏障的保护作用等间接或直接的方式调节微生物群的组成。这是首次研究CPT对RILF动物模型肠道菌群组成和BA代谢物的影响。首先，Sobs指数、Chao1指数和Ace指数水平降低，表明在RILF期间肠道微生物群高度失调。据报道，Erysipelatoclostridium在辐射诱导肠损伤(RIII)模型中明显增加，可为2级RIII提供良好的诊断标志物。本研究发现Erysipelatoclostridium是IR组的核心细菌，表明RILF伴肠损伤，加重肠-肺轴炎症反应，形成恶性循环。有趣的是，CPT治疗可以塑造肠道微生物群的多样性和组成，并增加有益菌的丰度。Akkermansia和Lachnospiraceae是CPT组的两个核心细菌。Akkermansia被认为是一种很有前景的益生菌，它在维持肠道黏液层的完整性方面起着关键作用，据报道它可以减少辐射引起的肠道损伤。高剂量辐射后，存活小鼠中Lachnospiraceae的丰度升高，这与辐射后造血功能恢复和胃肠道修复有关。其次，CPT恢复了27个BAs水平，经Spearman相关分析，这与肠道菌群的调节有关。FXR受体是一种BA受体，能维持BA代谢的稳定性。FXR也在非典型BAs靶组织(如肺)中表达，越来越多的证据表明，FXR激动剂在各种肺部疾病模型(如特发性肺纤维化和囊性纤维化)中具有有益作用。最近的一项研究证实，奥贝胆酸(FXR激动剂)可以阻断几种炎症信号通路，以减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。在本研究中，CPT显著降低了FXR拮抗剂(T-β-MCA)和天然激动剂(DCA、TDCA、LCA、TLCA、CDCA、TCDCA、CA和TCA)的比例，并且DCA和LCA的水平与CPT组富集的norank_f_ peptococcaceae、unclassified_f_ lachnospiraceae、Lachnoclostridium、Desulfovibrio、Enterorhabdus、Eubacterium_brachy_group和Akkermansia的丰度呈正相关。此外，在IR组小鼠中，作为核心细菌的Erysipelatoclostridium相对丰度与几种BA水平呈负相关，这表明它可能促进BA代谢紊乱。CPT组小鼠的核心细菌Lachnospiraceae和Akkermansia均显示出调节BA代谢的能力。Lachnospiraceae的减少可能导致癌症恶病质中BA的微生物代谢减少，Akkermansia可能上调BA-辅酶A的水平，以增加结合型初级BA的合成。在本研究中，Lachnospiraceae和Akkermansia的相对丰度与几种BA水平呈正相关，尤其是DCA和LCA。此外，FXR的天然激动剂DCA和LCA已被用于通过恢复肠道屏障功能和减少炎症来治疗炎症性肠病。因此，CPT可能主要通过增加Lachnospiraceae和Akkermansia的丰度来调节BA代谢和减轻炎症。此外，还研究了CPT对肺组织FXR激活的影响。不出所料，CPT处理小鼠FXR蛋白表达水平显著升高。上述结果表明，CPT通过改善肠道菌群和BAs代谢异常来缓解RILF，其抗炎作用可能通过激活肺FXR活性来实现。
因此，可以初步提出CPT从肠-肺轴治疗RILF的可能性。CPT显著改善RILF小鼠肠道菌群失调和BA代谢，恢复肠道屏障功能，增强免疫力，减轻肺纤维化。然而，在本研究中，CPT的有益作用是否主要通过靶向FXR信号通路来表达，还需要更多的实验证据来验证。本研究为提高CPT抗肺纤维化作用提供了新的视角，可能对未来RILF患者的治疗有益。
结论
综上所述，本研究从肠-肺轴角度验证了CPT对RILF的保护作用，特别是针对BA -肠道微生物轴。值得注意的是，CPT治疗可以抑制EMT过程，抑制炎症，减少RILF肺中ECM的沉积。此外，CPT治疗可以通过调节肠道菌群结构和BAs池，恢复微生物群和BA代谢系统的失调，减轻RILF引起的结肠损伤，恢复肠道屏障功能。总之，本研究的结果提供了一种新的CPT对抗RILF的机制，这为发现和开发治疗RILF的有希望的潜在药物提供了重要的基础。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ptr.7926
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