导读
急性肺损伤（ALI）是一种常见的破坏性呼吸系统疾病，与不受控制的炎症反应和中性粒细胞跨上皮迁移有关。近年来，越来越多的研究发现矮地茶（AJH）具有良好的抗炎作用，但其在ALI治疗中的血清物质基础和分子机制仍不清楚。本研究采用代谢组学和血清药物化学网络分析方法探讨AJH对脂多糖（LPS）诱导的ALI的治疗作用和分子机制。我们将12只进行血清药化学分析的大鼠随机分为LPS组和LPS+AJH处理组（用AJH提取物20 g/kg/d治疗），气管内滴注LPS（2mg/kg），连续给药7天。此外，我们将36只用于代谢组学研究的大鼠分为对照组、LPS、LPS+AJH处理组（5、10 和 20 g/kg/d）和LPS+地塞米松(Dex)组（2.3 × 10−4 g/kg/d）。第七次给药1 h后，LPS组、LPS+AJH组、LPS+Dex组通过气管内滴注LPS诱导ALI。我们采用UPLC-Orbitrap Fusion MS进行血清药化学分析，鉴定血清成分，通过网络分析进一步探讨AJH抗ALI的分子机制；同时，我们利用代谢组学筛选潜在的生物标志物和相关代谢途径，分析AJH抗ALI的治疗机制。结果显示，ALI大鼠血清中鉴定出71种血清成分和18种相关代谢物。我们在网络分析中发现AGE-RAGE、PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路经常涉及81个重叠靶标。LPS+AJH处理组通过减少炎症细胞浸润发挥对ALI的保护作用，并通过显着调节白细胞介素（IL）-6和IL-10水平实现抗炎功效。代谢组学分析表明，AJH对ALI的治疗作用涉及43个潜在生物标志物和14条代谢途径，尤其是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成和亚油酸代谢途径受到影响，这暗示了AJH治疗ALI的潜在机制。我们的研究初步阐明了AJH治疗ALI的物质基础和有效机制，为AJH的应用提供了坚实的基础。
论文ID
原名：Metabolomic profiling combined with network analysis of serum pharmacochemistry to reveal the therapeutic mechanism of Ardisiae Japonicae Herba against acute lung injury
译名：代谢组学分析结合血清药物化学网络分析揭示矮地茶抗急性肺损伤的治疗机制
期刊：Frontiers in Pharmacology
IF：5.6
发表时间：2023.07
通讯作者：李建生，冯素香
通讯作者单位：河南中医药大学
【福利时刻】科研服务（点击查看）：动物模型-行为学、中药含药血清及成分鉴定、代谢组学、网药生信、药理毒理、病理与影像学。
实验设计
实验结果
1. 生化参数及组织病理学分析
为了进行血清药物化学分析，我们将12只大鼠随机分为两组（每组6只）：LPS（用10 mL/kg/d 蒸馏水灌胃）和LPS+AJH处理组（用AJH提取物20 g/kg/d灌胃处理），各组大鼠气管内滴注LPS（2 mg/kg）诱导ALI，LPS暴露24小时后，LPS和LPS+AJH处理组连续给药7天（图1A）。在代谢组学分析中，大鼠共36只，分为对照组（10 mL/kg/d蒸馏水灌胃）、LPS（10 mL/kg/d蒸馏水灌胃）、LPS+AJH-low（LPS+AJH-L，用AJH提取物5 g/kg/d灌胃处理）、LPS+AJH-medium(LPS+AJH-M，用AJH提取物10 g/kg/d灌胃处理）、LPS+AJH-high(LPS+AJH-H，用AJH提取物20 g/kg/d灌胃处理），和LPS+地塞米松(LPS + Dex，用Dex 2.3×10−4 g/kg/d灌胃处理）。LPS+AJH处理组和LPS+Dex组连续施用7天，末次给药1 h后，LPS组、LPS+AJH组、LPS+Dex组腹腔注射20% urethane，气管内滴注LPS（2 mg/kg）建立ALI模型（图 1B）。与对照组相比，LPS组血清和BALF中IL-6显着上调，IL-10显着下调，表明ALI建模成功（p <0.01），如补充表S1所示。与LPS组相比，LPS+AJH组和LPS+Dex组的血清和BALF中IL-6水平降低，然而，IL-10表达显着增加（图2B）。IL-6和IL-10水平结果表明AJH的保护作用有明显改善。此外，AJH组通过调节支气管收缩和气道阻力改善了肺功能参数，但没有显着差异，如图2A和补充表S2所示。为了进一步确定AJH的治疗效果，我们检测并计算了肺W/D比值以及胸腺和脾脏指数（图2C和补充表S3）。与对照组相比，LPS组胸腺和脾脏指数均降低（p < 0.05和0.01）。LPS+AJH-H组和LPS+Dex组的胸腺指数和脾指数较LPS组显着升高（p<0.05和0.01）。此外，与对照组相比，LPS组的W/D（肺湿/干）比值显着增加，表明水肿严重（p < 0.01）。LPS+AJH处理组可以改善肺、胸腺和脾损伤。病理结果进一步表明，LPS组表现出明显的组织学变化，包括肺泡扩张、肺泡融合、气道壁增厚、大量炎性细胞向肺泡腔浸润。与LPS组相比，LPS+AJH处理组的病理变化减轻（图2D）。以上结果表明，ALI模型成功建立，LPS+AJH-L、LPS+AJH-M、LPS+AJH-H组对ALI有治疗作用（肺功能、肺W/D比值、胸腺和脾脏指数及组织学变化），这似乎是剂量依赖性的。AJH处理组还可以减少ALI的炎症。LPS+AJH-H组和LPS+AJH-M组的抗炎活性优于LPS+AJH-L组。
图1 血清药物化学和代谢组学实验中动物分组和处理的过程。（（A）血清药物化学分析；（B）代谢组学分析）。
图2 基于一般特征、生化分析和病理变化的AJH干预对ALI的影响。(A)大鼠肺功能分析相关指标的测定，包括呼吸间歇（penh）、呼吸暂停（PAU）、呼气中期流速（EF50）和最大呼气流速（PEFb）。(B)AJH调节血清和BALF中IL-6和IL-10的表达水平。(C)肺W/D比率以及胸腺和脾脏指数。与对照组相比，#p < 0.05，##p < 0.01；与LPS组相比，*p < 0.05，**p < 0.01。(D)ALI模型大鼠肺组织的组织病理学变化和AJH的影响((a)放大倍数×50，(b)放大倍数×200)。
2. ALI大鼠模型血清成分的表征和鉴定
UPLC-Orbitrap Fusion MS是一种高灵敏度、高准确度的仪器，用于鉴定ALI大鼠模型中的血清成分。总离子色谱图(TIC)如图3所示。在ALI大鼠中共鉴定出71种血清成分和18种相关代谢物，详细信息包括名称、保留时间和碎片离子见表1、表2。其中，山奈酚、杨梅甙、羟基芫花素等21种成分被归类为黄酮类化合物；岩白菜素、fraxetin、东莨菪素等八种成分被鉴定为苯丙素类；我们还观察到9种萜烯和3种醌、4种类固醇、26种羧酸和其他成分。此外，通过与参考标准品比较，我们鉴定出15种血清成分。
图3 ALI模型大鼠中AJH血清药物化学的总离子色谱图(TIC)；黄酮类（共21种）以蓝色标记，苯丙素类（共8种）以橙色标记，萜类（共9种）以绿色标记，醌类（共3种）以黑色标记，类固醇（共4种）紫色标记，羧酸等成分（共26种）红色标记。（a1-3.正离子模式；b.负离子模式）。
表1 ALI大鼠中AJH的71种血清成分的详细信息
表2 ALI大鼠中AJH血清成分18种相关代谢物的详细信息
3. 基于ALI大鼠模型血清成分的网络分析
在网络分析中，我们从UPLC-Orbitrap Fusion MS鉴定的71种血清成分中分析并筛选出了40种成分，这些成分作用于81个重叠靶点。AJH-血清成分-靶点-ALI网络（图4A）包括122个节点（1个AJH、40个血清成分和81个靶点）和422条边。各成分的平均度值为6.9，表明该成分通过调节多个靶点来达到AJH对抗ALI的治疗效果。此外，羟基芫花素、木犀草素、芹菜素、山奈酚和槲皮素分别作用于28、27、27、26和24个靶点。由于上述五个成分在该网络中的重要地位，因此被选为核心成分。
图4 AJH干预ALI的网络药理学预测。(A)AJH-血清成分-靶标-ALI网络。(B)PPI网络。
我们发现了81个重叠靶点来构建PPI网络（图4B），平均节点度值为34.5，其中36个靶点（度值>34.5）被选为核心靶点。具有拓扑意义的核心靶点包括TNF、肿瘤蛋白（TP）53、白蛋白（ALB）、IL-6、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）1、血管内皮生长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和Toll样受体（TLR）4可能在AJH抗ALI的分子机制中发挥重要作用。基因本体（GO）生物过程（BP）、GO细胞成分（CC）和GO分子功能（MF）的数量分别为1,499、62和108。我们筛选了所有前20个p值的GOBP、GOCC和GOMF，并用带有p值的图形气泡表示，如图5A-C和补充表S4所示。最终我们发现了171条相关信号通路，前20个p值由图形气泡表示，如图5D和补充表S5所示，其中包括PI3K-Akt、AGE-RAGE和JAK-STAT信号通路。
图5 GO和KEGG富集分析的结果。(A)GOBP的气泡图；(B)GOMF；(C)GOCC；(D)KEGG富集分析。
4. 代谢组学分析
根据建立的UPLC-Orbitrap Fusion MS分析方法，我们对对照组、LPS组、LPS+Dex、LPS+AJH-L、LPS+AJH-M、LPS+AJH-H组的血清样本数据进行分析，得出TIC谱如图6A所示，总共注释和鉴定了102种代谢物（表3）。PCA可以对复杂数据集进行降维，形成几个主要成分，反映不同群体的自然分布，并发现异常值。我们使用SIMCA 14.1软件对每组102种代谢物的数据进行分析，建立PCA评分图（图6B）。对照组、LPS、LPS+Dex和LPS+AJH处理组明显分散和聚集。另外，对照组与LPS组明显分离，进一步证明ALI大鼠模型重复成功，如图6B所示。与对照组和LPS组相比，LPS+Dex和LPS+AJH处理组接近对照组，远离LPS组。上述PCA结果说明了AJH干预ALI的有效性。
图6 基于多元统计方法的代谢组学分析。(A)代谢样品的总离子色谱图(TIC)(a.正离子模式；b.负离子模式)；(B)3D PCA得分图；(C)3D PLS-DA得分图；(D)VIP图。
表3 血清样品中的代谢物
为了进一步选择潜在的生物标志物并确定对照组与LPS组之间、对照组、LPS组和LPS+AJH处理组之间以及对照组、LPS组和LPS+Dex组之间的差异，我们将代谢组学数据置于 PLS-DA 的监督方法中（图 6C）。PLS-DA模型中的R2X、R2Y和Q2分别为0.782、0.964和0.916（Q2>0.5）。在设置200次排列后，我们应用PLS-DA模型的排列检验来进一步评估可靠性水平。如补充图S1所示，Y排列模型的所有Q2和R2值均低于原始模型，这表明PLS-DA模型具有显着的解释或预测能力，并且没有过度拟合。基于 VIP >1.0（图 6D），我们选择了43个成分作为潜在的生物标志物，如表3所示。
图7A中，对照组和LPS组呈散聚状，表明ALI大鼠模型建立成功。然后，对照组、LPS和LPS+Dex/AJH-H/AJH-M/AJH-L组明显聚集成三个单独的组并且彼此分开（图7A），排列检验的结果表明：PLS-DA模型可靠且不会过度拟合（图 7B）。根据质谱、HCDM、Compound Discoverer数据库和参考文献的裂解规律，我们鉴定了43个潜在的生物标志物。我们进一步分析各组中鉴定出的生物标志物的含量水平和趋势，如图8A、B所示。与对照组相比，LPS 组中L-苯丙氨酸、亚油酸、L-酪氨酸、吲哚-3-乙酸甲酯、丙酰肉碱、2-甲基马尿酸、DL-肉碱、皮质酮、肌酸、新石房蛤毒素、5-HEPE、3-羟基癸酸、3-苯基乳酸、伊洛前列素、喹啉、二十碳五烯酸、甲基丙二酸和 2-羟基肉豆蔻酸显着上调(p < 0.05/p < 0.01)。LPS 组的硬脂酸、D-(+)-色氨酸和马尿酸水平下调 (p < 0.05/p < 0.01)。我们发现LPS+AJH处理组对上述潜在生物标志物具有回调效应（p < 0.05 和 p < 0.01）。再次，LPS+AJH-M组和LPS+AJH-H组的治疗效果优于LPS+AJH-L组。
图7 对照组和LPS组之间，对照组、LPS和LPS+Dex组之间，对照组、LPS和LPS+AJH-H组之间，对照组、LPS和LPS+AJH-M组之间以及对照组、LPS组和LPS+AJH-L组的代谢组学分析。(A)PLS-DA得分图；(B)PLS-DA模型的排列检验。
图8 每组中潜在代谢组生物标志物的系统分析。(A)潜在代谢组生物标志物相对含量的直方图（与对照组相比，#p < 0.05，##p < 0.01；与LPS组相比，*p < 0.05，**p < 0.01）。(B)对照、LPS、LPS+Dex、LPS+AJH-H、LPS+AJH-M和LPS+AJH-L组中潜在代谢组生物标志物的热图。(C)使用MetaboAnalyst 5.0进行与ALI发病机制相关的代谢途径分析（a. 亚油酸代谢；b. 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；c. 苯丙氨酸代谢；d. 酪氨酸代谢；e. 色氨酸代谢；f.类固醇激素生物合成；g. 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解；h. 精氨酸和脯氨酸代谢；i. 泛酸和CoA生物合成；j. 氨酰-tRNA生物合成；k. 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成；l. 泛醌和其他萜类醌生物合成；m.甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；n.不饱和脂肪酸的生物合成）。
为了进一步对ALI相关代谢途径进行分类，我们将鉴定出的43个代谢生物标志物导入MetaboAnalyst 5.0软件中，得到14条代谢途径，如图8C和表4所示。根据通路影响值大于0.1的筛选标准和文献报道，我们得到与AJH干预ALI密切相关的4条代谢通路：亚油酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢和酪氨酸代谢。
表4 14条代谢途径的详细信息
讨论
ALI是由于炎症细胞因子过度释放，破坏炎症和抗炎细胞因子的平衡而引起的，可进一步发展为全身炎症反应综合征（SIRS）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS），最终发展为多器官功能衰竭（MOF）。因此，炎症在ALI，特别是慢性阻塞性肺疾病和慢性阻塞性肺疾病急性加重中具有重要意义。炎症导致炎症细胞浸润，并释放趋化因子和促炎细胞因子。相关研究表明TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18与ALI的结局关系最为密切，是目前诊断和预后的方法。有研究者表明氟非尼酮通过改善肺组织结构并降低BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平对ALI发挥治疗作用。在我们的研究中，与对照组相比，ALI模型大鼠血清和BALF中IL-6和IL-10的水平显着上调或下调，可能暗示了AJH具有抗炎能力。此外，LPS组的肺湿/干比（W/D）以及胸腺和脾脏指数均显着升高。AJH处理组上述指标也有不同程度的改善。因此，我们的研究证明AJH可以改善肺功能并减少全身炎症，并为AJH在多个层面上的抗炎作用提供证据。在我们的组织病理学研究中，AJH处理组的明显炎症细胞浸润、肺泡扩张和融合以及细支气管狭窄均得到不同程度的改善。
在我们之前的研究中，我们鉴定了AJH中的236个成分。网络分析表明，有41个核心成分可以调节炎症相关通路，且核心成分具有抗炎作用。据《本草拾遗》记载，AJH具有消肿、化痰、止咳的功效，广泛用于治疗咳嗽、喘息、痰中带血、慢性支气管炎、湿热黄疸等病症。有研究者调查发现AJH可有效预防呼吸系统疾病，可缓解慢性阻塞性肺疾病的症状并改善肺功能。近年来，网络分析从网络角度阐释了生物系统、药物和疾病之间复杂的相互作用，为研究中药方作用机制开辟了新的研究思路和技术手段。在我们的研究中，我们进一步鉴定了ALI大鼠的血清成分，并利用集成网络分析和代谢组学研究AJH在ALI治疗中的治疗效果。我们在ALI大鼠模型中共鉴定出71种血清成分和18种相关代谢物，主要包括黄酮类、苯丙类和萜类。
由于AJH中的血清成分可能作用于不同的潜在靶点，我们收集了血清成分的靶点和与ALI相关的靶点，通过网络分析进一步探讨AJH抗ALI的机制。根据AJH-成分-靶点-ALI网络中的程度值，我们选择了五种核心血清成分，包括羟基芫花素、木犀草素、芹菜素、山奈酚和槲皮素。上述AJH的核心血清成分属于黄酮类化合物，黄酮类化合物普遍存在于所有维管植物中，并已被认为在体外和体内具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗过敏和抗癌活性。有研究者发现，羟基芫花素、木犀草素和芹菜素通过抑制NO的产生，在LPS激活的RAW264.7细胞中发挥免疫调节功能，NO具有显着的抗炎和抗氧化活性。在我们之前的研究中，木犀草素、山奈酚和槲皮素通过调节TNF-α诱导的A549细胞模型中的IL-6和MMP9水平显示出抗炎作用。此外，我们构建了PPI网络以在81个重叠靶点中选择关键靶点，包括TNF、TP53、ALB、IL-6、AKT1、VEGFA、EGFR、MAPK和TLR4。相关研究表明IL-6、VEGFA、EGFR和MAPK与ALI的炎症发病机制有关，可以调节这些关键靶点以实现AJH对抗ALI的抗炎活性。根据GO和KEGG分析，81个重叠靶点中有一些靶点是高度富集的炎症相关通路，包括PI3K-Akt、AGE-RAGE和JAK-STAT信号通路。Yu等人表明AGE-RAGE信号通路被激活，进一步增加了促炎细胞因子的水平，包括IL-1β和TNF。相关研究表明，PI3K-AKT可以调节下游炎症细胞因子，在炎症反应中发挥着至关重要的作用。因此，AJH的血清成分可能作用于81个重叠靶点来调节炎症相关通路。
代谢组学分析揭示了一些与AJH对LPS诱导的ALI的治疗效果相关的潜在生物标志物。ALI大鼠模型中L-苯丙氨酸的上调和L-酪氨酸的下调是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的中间路径，Capuron等人表明，炎症的增加与色氨酸水平的降低有关，其改善了色氨酸的分解代谢，并且炎症与苯丙氨酸水平升高（酪氨酸水平下降）有关。我们发现LPS+AJH处理组的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸浓度有所回升，表明AJH对LPS诱导的ALI大鼠有处理作用。此外，由于线粒体容易受到氧化应激和促炎介质的影响，脂多糖诱导的巨噬细胞炎症环境降低了线粒体的核心酶水平，影响了与柠檬酸循环稳定性密切相关的线粒体功能。在我们的研究中，LPS+AJH处理组中与柠檬酸循环相关的肌酸水平显着下调，这表明AJH可以通过恢复紊乱的代谢来保护LPS诱导的ALI大鼠。此外，相关研究表明脂肪酸及其衍生物在多种生理过程中发挥着重要作用，具有内源性抗炎、抗菌、抗真菌、抗病毒和免疫调节作用，被认为是与炎症相关的临床诊断指标。亚油酸作为典型的必需脂肪酸，是一种前体，可生成二高-γ-亚麻酸和花生四烯酸。根据我们的结果，ALI大鼠中的亚油酸水平有所增加，但其浓度在LPS+AJH处理组中有所回升。前期研究表明，花生四烯酸作为炎症介质（类二十烷酸）的重要前体，可以调节炎症和免疫反应。同时，花生四烯酸与TLR4和MAPK等炎症通路相关，这可以从我们的网络分析结果中得到证明。此外，在我们的研究中，ALI大鼠中102种代谢物中的花生四烯酸水平降低，可能转化为促炎产物，与之前的结果一致。
因此，AJH对潜在生物标志物代谢的调节可能与通过血清成分网络分析选择的炎症相关途径的调节有关。此外，我们进一步假设AJH通过调节潜在的生物标志物，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及亚油酸代谢中的L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和亚油酸水平，在LPS诱导的ALI模型中发挥抗炎活性。因此，AJH对苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成和亚油酸代谢的调节可能与其减轻体内炎症反应以改善LPS诱导的ALI有关。我们的研究通过网络分析和非靶向代谢组学初步阐明了AJH治疗ALI的血清物质基础和有效机制。为了更好地理解潜在生物标志物的分子机制和相关代谢途径，我们需要进一步研究靶向代谢组学、蛋白质组学和基因组学。
结论
本研究结合代谢组学和血清药物化学网络分析，系统揭示了AJH治疗ALI的物质基础和分子机制。UPLC-Orbitrap Fusion MS共鉴定出71种血清成分和18种相关代谢物。我们对上述血清成分进行网络分析后，筛选出5种核心黄酮成分。我们初步假设AJH通过调节核心靶点（包括 TNF、TP53、ALB、IL-6、AKT1、MAPK 和 TLR4）以及相关信号通路（PI3K-Akt、AGE-RAGE 和 JAK-STAT）来治疗ALI，为AJH治疗ALI的具体分子机制奠定了基础。同时，代谢组学结果表明，AJH通过减轻肺泡腔炎症细胞浸润、调节炎症细胞因子的表达来有效治疗ALI。AJH可能与逆转苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及亚油酸代谢途径的异常相关，从而将潜在生物标志物的浓度调节至正常水平。因此，AJH 可以减轻ALI治疗中的炎症反应。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2023.1131479/full
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