导读
四君子汤（SJZD）是临床上常用的治疗胃癌前病变（GPL）的中药方剂，目前不完全清楚四君子汤的胃保护机制。本研究旨在系统评价SJZD阻断GPL发展的疗效，并揭示其潜在机制。首先，我们建立了大鼠GPL模型，该模型由N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）联合不规则饮食和40%酒精诱导。然后，基于稳定同位素二甲基标记的定量蛋白质组学揭示了SJZD的药效机制。同时，通过定量代谢组学验证了其药效机制。此外，通过血清药理学方法在细胞模型中证实了SJZD的抗胃炎作用，并进一步验证了其作用机制。结果证明SJZD可以阻断GPL在动物模型中的发展。蛋白质组学和代谢组学显示SJZD通过调节氧化磷酸化（OXPHOS）阻断GPL的发育。此外，血清药理学结果表明，含SJZD的血清（SJZD-CS）可抑制MNNG诱导的GES-1细胞凋亡 。OXPHOS抑制剂可显著降低SJZD-CS的保护作用。SJZD有效改善GPL，蛋白质组学和代谢组学揭示其保护作用与OXPHOS密切相关。
论文ID
原名：Sijunzi decoction ameliorates gastric precancerous lesions via regulating oxidative phosphorylation based on proteomics and metabolomics
译名：基于蛋白质组学和代谢组学揭示四君子汤通过调节氧化磷酸化改善胃癌前病变
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.07
通讯作者：戴建业
通讯作者单位：兰州大学药学院
实验设计
实验结果
1. SJZD能显著改善MNNG联合酒精和不规律饮食诱导的GPL
我们采用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）联合酒精和不规律饮食诱导的GPL模型来评价SJZD的疗效。处理20周后，从动物身上采集胃组织和血清，观察病理切片并分析生化指标。两组之间的体重没有显著差异（图1A）。HE染色显示，模型组肌肉层炎症细胞和肥大细胞浸润增加，腺体肠化生明显。在给予维生素辅酶和SJZD后，上述这些指标都被恢复（图1B）。进一步分析血清生物标志物超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。SJZD处理后，SOD和GSH-Px水平显著升高，LDH水平降低（图1C–E）。LDH是糖酵解过程中丙酮酸转化为乳酸的关键酶，为肿瘤生长提供能量。超氧化物歧化酶调节细胞产生的超氧化物和过氧化氢水平，进而调节细胞信号传导。GSH-Px通过将氢和有机过氧化物的还原与谷胱甘肽（GSH）氧化为谷胱甘肽二硫化物（GSSG）相结合来保护细胞免受氧化应激。生物标志物丙二醛（MDA）和肌酸激酶（CK）的结果如图S1A和B所示。
图1 SJZD治疗胃癌前病变的疗效
（A）实验动物的体重变化曲线没有显著差异。（B）胃组织HE染色显示SJZD具有良好的抗GPL作用。（C）SJZD改善GPL疾病模型中血清SOD水平的下降。（D）SJZD改善GPL疾病模型血清LDH水平的升高。（E）SJZD改善了GPL疾病模型血清GSH-Px水平的下降。与对照组相比，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。与模型组相比，# P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001（n = 6）。
2. 定量蛋白质组学揭示SJZD的药效机制
基于稳定同位素二甲基标记的定量蛋白质组学分析，通过鉴定三组中差异表达的蛋白质，我们探索SJZD的药效机制（对照组、模型组、SJZD高剂量组，n = 每组6只大鼠）（图2A）。选择模型组与对照组筛选的157种差异表达蛋白和SJZD组与模型组筛选的187种差异表达蛋白质进行后续分析（图2B）。模型组中受影响的信号通路、分子功能、生物过程和细胞成分（图2C和D）在SJZD治疗后恢复（图2E和F）。由于炎症伴随氧化应激是GPL发展过程中胃粘膜损伤的关键原因，氧化磷酸化（OXPHOS）是我们关注的焦点。此外，我们构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络，大多数具有较高自由度的蛋白质与OXPHOS相关（图S2A和B）。总之，我们的数据表明，SJZD通过调节OXPHOS对GPL的发展发挥保护作用。
图2 SJZD的定量蛋白质组学实验结果
（A）定量蛋白质组学的流程图。（B）模型组和SJZD治疗组差异蛋白的维恩图。（C，D）模型组（与对照组）中干预的差异蛋白的KEGG和GO分析。（E、F）SJZD处理组（与模型组）中恢复的差异蛋白的KEGG和GO分析。
3. 定量代谢组学显示SJZD通过调节氧化磷酸化而有效
为了验证SJZD是否通过调节OXPHOS发挥其药用作用，我们进行了定量代谢组学分析，以揭示SJZD治疗后胃组织中的代谢产物。我们在对照组、模型组和SJZD组中测定了221种代谢物（图S3B）。进行主成分分析（PCA）以证明各组之间的差异。SJZD治疗后观察到显著的回归（图3C）。氨基酸、脂肪酸和有机酸的丰度在三组之间存在显著差异（图S3C）。差异代谢产物的KEGG分析显示，模型组中受影响的大多数代谢途径在SJZD治疗后恢复（图3A和B）。此外，在模型组中，葡萄糖水平降低，乳酸和丙酮酸水平（糖酵解）增加（图3D），柠檬酸水平（三羧酸[TCA]循环）增加，富马酸水平和富马酸与琥珀酸的比例降低（图3E）。用SJZD治疗后，胃组织中的糖酵解减少，TCA循环恢复（图3D和E）。线粒体内膜可以选择性地协调OXPHOS相关代谢产物的运输。SJZD治疗后，苹果酸、天冬氨酸、肉碱和瓜氨酸的异常转运得以恢复（图3F）。结合蛋白质组学和代谢组学结果，我们得出结论，SJZD可能通过调节线粒体中的OXPHOS来阻断GPL的发展。
图3 定量代谢组学实验结果
（A）KEGG代谢途径干预模型组（vs对照组）。（B）KEGG代谢途径干预SJZD治疗组（vs模型组）。（C）对照组、模型组和SJZD治疗组的PCA分析。（D）葡萄糖、乳酸和丙酮酸水平的变化被用来表明SJZD对于糖酵解的抑制（n = 4）。（E）柠檬酸、富马酸水平的变化以及富马酸与琥珀酸的比例被用来指示SJZD对TCA的激活（n = 4）。（F）线粒体运输的OXPHOS相关代谢产物苹果酸、天冬氨酸、肉碱和瓜氨酸水平升高（n = 4）。与对照组相比，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。与模型组相比，# P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001。
4. 血清药理学证实SJZD可通过OXPHOS改善MNNG诱导的GES-1 细胞凋亡
为了证实SJZD通过调节OXPHOS发挥其作用，MNNG诱导的GES-1 细胞被用作GPL的细胞模型。CCK8、台盼蓝染色和吉姆萨染色实验表明，含有SJZD的血清（SJZD-CS）可以减少MNNG对GES-1细胞的损伤 （图4A–D）。IACS-010759是OXPHOS复合物I的抑制剂。IACS-010759处理后SJZD-CS对MNNG损伤GES-1细胞的保护作用明显减弱。因此，SJZD可以通过激活OXPHOS途径发挥其药用作用（图4E）。
流式细胞术用于检测细胞凋亡。我们发现SJZD-CS可以显著抑制MNNG诱导的GES-1细胞凋亡 。此外，CCK8和台盼蓝染色实验表明，SJZD-CS可以通过增加ROS水平来降低人胃腺癌细胞的存活率（图S4D-F）。ROS主要由线粒体呼吸链的复合物I和复合物III产生，ROS的增加与OXPHOS的激活有关。
讨论
癌症难以完全治愈，发病率高。癌症的发生与人们不良的饮食习惯密切相关。除了饮食中感染幽门螺杆菌外，腌制食品中的N-亚硝基化合物、过量饮酒和不规律饮食都会导致GPL并引起癌症的发生。近年来，中医药已被广泛应用于恶性肿瘤的治疗。因此，从中医学角度研究预防和治疗癌症的策略是可行的。
SJZD是一种常用于临床治疗胃肠道疾病的中药配方。有两种用药方式，一种是以人参为主要药材（君药），另一种以党参为主要药材（君药）。作为君药。党参在临床实践中经常在SJZD配方中使用以治疗GPL。这可能是由于党参与人参配方相比，该SJZD配方能够极大地清除具有直接细胞毒性的自由基，自由基会对胃黏膜造成严重损伤。此外，党参的市场价格比人参低很多。我们之前的研究也表明，党参对氧化应激损伤具有保护作用，并降低LDH水平，LDH促进肿瘤发展，调节GPL发展过程中的能量代谢。因此，我们推测党参在SJZD治疗GPL中发挥重要作用。此外，其他三种中草药在治疗胃部疾病方面也具有药理作用。白术可以通过干扰白细胞介素17信号通路来保护胃肠道，茯苓通过糖皮质激素受体介导的PI3K/Akt/NF-κB改善肠道屏障功能，以及甘草可通过清除氧自由基和作为抗炎剂用于治疗胃肠道疾病。然而，SJZD的具体药效机制尚未得到很好的研究，限制了SJZD在临床上的应用。
我们分析了影响GPL发展的因素，并建立了动物模型来研究SJZD的药理机制。血清分析显示，模型组中LDH水平升高，我们推测这促进了细胞质中的有氧糖酵解，从而减少了丙酮酸进入TCA循环（图1D）。SJZD治疗后LDH水平的显著降低可能会改变能量代谢，抑制有氧糖酵解，从而通过OXPHOS途径产生能量（图3D和E）。这与我们的代谢组学结果一致。我们的数据表明，SJZD通过调节OXPHOS发挥其药用作用（图5）。
图5 SJZD通过OXPHOS抑制GPL的机制示意图
OXPHOS是细胞中ATP的主要来源。然而，与主要通过线粒体OXPHOS获得ATP的正常细胞不同，癌症细胞中ATP的主要来源是糖酵解途径，这被称为“Warburg效应”。这是因为糖酵解过程中产生的缺氧微环境更有利于癌症细胞的增殖。在GPL的发展过程中，含有许多糖蛋白的胃粘膜首先受到损伤。此外，粘膜中线粒体呼吸复合体I的水平和细胞呼吸能力降低，限制了线粒体ATP的产生和对粘膜滋养层分泌功能的能量支持。下调的OXPHOS蛋白UQCRQ、NDUFB7和UQCRC2在胃癌细胞中的高表达与较好的预后呈正相关。这些研究都表明GPL的发展与OXPHOS通路密切相关。
NADH的过度积累不仅通过影响OXPHOS途径导致能量代谢的改变，而且还会对身体造成严重损伤。例如，过量的电子供应导致高NADH/NAD+比率，从而导致线粒体功能障碍，这是代谢性疾病的一个特征。与此同时，研究人员还发现，过量的NADH会导致氧化应激，加剧对身体的氧化损伤。线粒体蛋白质含量的降低不仅与能量代谢有关，还可能导致线粒体介导的细胞凋亡。研究证实，在GPL发展的早期，胃黏膜上皮细胞的凋亡增强，许多药物可以通过抑制胃黏膜上皮的凋亡来保护胃黏膜。例如，茶黄素通过下调有丝分裂激活的蛋白激酶途径，减轻乙醇诱导的氧化应激和胃粘膜上皮细胞凋亡。广藿香精油与陈皮复合物（比例为1:2）可抑制胃黏膜上皮细胞凋亡，修复受损的胃黏膜。
在这项工作中，Ndufa10的表达在GPL组中减少。用于合成DNA的鸟苷核苷（dGTP）水平的改变促进了细胞凋亡，大多数线粒体dGTP通过Ndufa10和复合物I紧密相连，这证实了Ndufa110的缺乏与细胞凋亡密切相关。除了Ndufa10与细胞凋亡之间的关系外，与细胞色素c有关的Cox7c和Cox7b可以催化电子从还原的细胞色素c转移到氧。我们推测Cox7c和Cox7b的表达减少可能与细胞色素c介导的细胞凋亡有关。细胞水平的凋亡蛋白检测也证实了MNNG诱导后凋亡蛋白的表达显著增加，但SJZD治疗后凋亡显著抑制，这可能是SJZD保护胃黏膜的机制之一。
此外，我们的实验证实，OXPHOS与GPL的发展密切相关，OXPHOS抑制剂IACS-010759显著削弱了SJZD的疗效（图4E）。因此，我们认为激活OXPHOS可能是阻断GPL发展的有效措施。然而，尚需进一步研究SJZD的特异性活性成分及其确切的药理靶点。
结论
我们的研究结果表明，SJZD可以激活OXPHOS来阻断GPL的发展。此外，我们使用OXPHOS抑制剂直接证实了SJZD的作用机制与OXPHOS有关。SJZD药效机制的发现为探索中药的作用机制提供了新的参考。调节OXPHOS影响能量代谢可为癌症的早期治疗提供新的策略。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874123007936?via%3Dihub
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