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导读
慢性应激越来越被认为是一种健康风险因素，并与几种疾病的发展有关，包括神经精神障碍(如抑郁症)和功能性胃肠疾病(如肠易激综合征)。应激相关疾病的病因是复杂和多因素的。“微生物-肠道-脑轴”的双向交流已被证明是一个稳定的模型，并在应激相关疾病的病因和治疗中的潜在作用受到越来越多的关注。近年来，由于天然多糖具有多种生物功能，已成为一种流行的膳食营养元素。天然多糖可以通过重塑肠道微生物群组成、保护肠道屏障功能和减少促炎症介质来抑制肠道过度炎症反应。杜仲是一种传统的滋补中药，具有一定的神经保护作用及抗炎特性。杜仲多糖(Eucommiae cortex polysaccharides, EPs)是从杜仲皮中分离出来的主要活性物质之一，具有较强的抗氧化和免疫调节功能。我们以前的研究表明，EPs可以通过重塑肠道微生物群来改善致肥饮食引起的系统性低度炎症。然而，这种作用模式是否可以应用于改善慢性温和不可预知应激模型小鼠抑郁样症状和肠道菌群失调，尚未得到进一步研究。本研究旨在探究EPs对慢性应激诱导的肠道菌群失调和神经炎症的有益作用。结果发现，慢性不可预知温和应激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)破坏了小鼠肠道菌群组成，诱导神经炎症，继而引发行为和生理缺陷。而补充EPs减轻了CUMS小鼠的生理应激反应，包括菌群失调、肠道通透性增加以及神经炎症反应。同时，EPs恢复了CUMS小鼠的神经发生节律，并表现出行为学测试特异性的抗抑郁和抗焦虑作用。本研究表明，EPs对CUMS引起的神经炎症和抑郁样症状有改善作用，这可能与其对肠道菌群组成的有益影响密切相关。
论文ID
原名：Eucommiae cortex polysaccharides attenuate gut microbiota dysbiosis and neuroinflammation in mice exposed to chronic unpredictable mild stress: Beneficial in ameliorating depressive-like behaviors
译名：杜仲多糖减轻了慢性不可预知温和应激诱导的小鼠肠道菌群失调和神经炎症：有利于改善抑郁样行为
期刊：Journal of Affective Disorders
IF：6.6
发表时间：2023.5
第一作者：王梦丽，孙朋浩
通讯作者：赵善廷，朱晓岩，柴学军
通讯作者单位：西北农林科技大学动物医学院；西安医学院基础医学部
DOI号：10.1016/j.jad.2023.04.117
实验设计
结果
1. EPs改善了CUMS诱导的抑郁样症状
为了研究抑郁样症状的发展，我们测试了4周CUMS建模后小鼠的行为表型(图1A)。与对照组相比，CUMS小鼠静止时间明显增加(图1B，C)，说明小鼠在CUMS的刺激下出现了抑郁样行为。在补充EPs两周后(图1A)，EPs逆转了抑郁样行为，这表现在悬尾和强迫游泳的静止时间明显减少(图1D，E)。此外，如图1F和G所示，与CUMS组相比，EPs组在旷场实验和高架十字迷宫实验中开阔场地表现出更强的运动性。总之，这些数据表明，补充EPs可明显缓解CUMS诱导的抑郁和焦虑样行为。
图1. 补充EPs改善了CUMS诱导的抑郁样症状。
2. EPs减轻了CUMS诱导的肠道生态失调
本研究利用Chao1指数进行α多样性分析，结果显示CUMS显著降低了菌群丰富度，而补充EPs则相反，说明EPs有效促进了肠道微生物群落的稳定性(图2A)。此外，通过基于Bray-Curtis距离的PCoA对肠道菌群的整体结构进行了分析。CUMS小鼠表现与对照组和EPs小鼠明显不同的特殊的菌群特征，这反映出肠道生态失调与CUMS之间存在强烈关联(图2B, C)。值得注意的是，EPs组的菌群比CUMS组更接近于对照组(图2B, C)，这表明EPs对CUMS诱导的肠道菌群失调有保护作用。进一步LEfSe分析(LDA > 3.0, P < 0.001)显示，CUMS显著降低了Lactobacillaceae的丰度，而潜在的病原体，如Proteobacteria、Clostridiales和Prevotellaceae (图2D-T)丰度增长。与菌群多样性的重塑效应一致，补充EPs显著提高了Lactobacillaceae的丰度，抑制了Proteobacteria、Clostridiales和Prevotellaceae的扩张(图2D-T)。上述结果提示，EPs可有效缓解CUMS诱导的肠道菌群失调。
应激引起的菌群失调破坏了肠道屏障和免疫平衡。因此，我们研究了EPs对CUMS小鼠结肠组织的影响。ZO-1是肠道黏膜上皮细胞之间紧密连接的重要组成蛋白之一。与对照组相比，暴露于CUMS的小鼠中ZO-1的蛋白表达减少，表明CUMS明显增加了结肠的通透性。有趣的是，EPs明显抑制CUMS小鼠ZO-1蛋白的下调(图3A，B)。此外，CUMS致使小鼠出现结肠炎，其特征是炎症细胞因子的上调，包括TNF-α和MCP-1(图3C，D)。与对肠道屏障的有利影响一致，EPs明显抑制了结肠组织中TNF-α和MCP-1的mRNA水平(图3C，D)。此外，与对照组小鼠相比，CUMS小鼠结肠中iNOS阳性细胞的密度明显增加，这是结肠炎的标志。有趣的是，补充EPs后，这种缺陷被改善了(图3E，F)。综上，EPs能有效地缓解CUMS相关的结肠损伤和炎症。
图2. EPs改善了CUMS诱导的肠道菌群失调。
图3. EPs减轻了CUMS引起的结肠损伤和炎症。
3. EPs抑制了CUMS诱导的小胶质细胞介导的TLR4/NFκB/MAPK通路激活
与Proteobacteria扩张一致，CUMS小鼠的血清LPS水平急剧增加(图3G)，这可能归因于肠道失调，包括菌群紊乱、炎症和肠道屏障失调(图2A-T；图3A-F)。全身暴露于LPS会激活小胶质细胞，继而上调海马中促炎细胞因子的表达。这一机制证明了肠道菌群在CUMS相关的神经炎症中的触发作用。慢性压力与神经炎症密切相关，并伴随着小胶质细胞的过度激活。齿状回是海马的一个关键脑区，参与认知功能、记忆过程和情绪调节。接下来，我们量化了海马齿状回中小胶质细胞的密度，以检查补充EPs对神经炎症的抑制作用(图4A)。与对血清LPS浓度的抑制作用相一致(图3G)，补充EPs后，CUMS小鼠齿状回中的小胶质细胞的密度明显降低(图4B)。为探究CUMS暴露后EPs对小胶质细胞形态变化的重塑作用，我们通过骨架和分形分析评估小胶质细胞形态(图4C-E)。结果显示，补充EPs可抑制CUMS诱导的小胶质细胞过度分支状态(图4E)。
LPS介导的TLR4级联信号触发了大脑中促炎症细胞因子的分泌，促使CUMS小鼠出现持续的炎症反应。为了确定EPs抑制小胶质细胞激活反应的潜在分子机制，我们检测了海马中TLR4、NF-κB p65和p-p38的激活情况(图4F)。为此，我们对NF-κB p65和p-p38进行了量化，以此作为NF-κB和MAPK激活的指标。CUMS小鼠海马中的TLR4、NF-κB p65和p-p38蛋白水平明显增加，这表明TLR4/NF-κB/MAPK信号通路被CUMS激活。然而，这一过程被EPs的补充所抑制(图4G-I)。TLR4/NF-κB/MAPK通路的激活导致了炎症细胞因子的大量分泌，如IL-6和IL-1β，它们发挥了强大的炎症作用。我们进一步测量了海马中炎症细胞因子的mRNA水平(图4J，K)。补充EPs可以减少CUMS诱导的IL-1β和IL-6的过度分泌(图4J，K)。这些结果表明，EPs通过抑制TLR4/NFκB/MAPK通路激活的潜在机制，减轻了CUMS诱导的小胶质细胞的促炎症反应。
图4. EPs通过抑制CUMS小鼠的TLR4/NFκB/MAPK信号通路改善小胶质细胞的促炎反应。
4. EPs恢复了CUMS小鼠海马神经发生的节律
在神经炎症的背景下，成体神经生成的缺陷与抑郁样症状有关。此外，越来越多的证据表明，中枢神经系统和外周的炎症反应参与了削弱成体神经生成的过程。为了研究EPs对CUMS小鼠成体神经发生的影响，在实验结束前腹腔内注射BrdU(图1A)。在这项研究中，用BrdU和Prox1的抗体进行双免疫荧光染色，用以标记新生颗粒细胞(图5A)。我们观察到，CUMS对颗粒细胞下层BrdU+细胞的数目没有明显影响(图5E)，而减少了Prox1和BrdU共同标记的新生颗粒细胞的数目(图5F)。我们进一步通过BrdU+Prox1+)/BrdU+的比例来评估新生神经祖细胞的分化能力。我们的研究结果显示，CUMS小鼠中(BrdU+Prox1+)/BrdU+的比率明显低于对照组(图5G)，表明CUM小鼠中新生的颗粒细胞减少。伴随着对海马神经炎症的抑制作用，补充EPs后，新生颗粒细胞(BrdU+Prox1+)的数目和(BrdU+Prox1+)/BrdU+的比例都明显增加，表明EPs有效地逆转了CUMS诱导的海马成体神经发生的缺陷(图5F，G)。为了进一步研究EPs对CUMS小鼠新生颗粒细胞生成的有利影响，我们用BrdU和GFAP(放射状胶质细胞，一种成体神经干细胞的标记物)进行双免疫荧光染色，标记和分析新生神经干细胞的数目(图5B, D)。与对照组相比，CUMS小鼠的BrdU+GFAP+RGLs数目明显减少。有趣的是，在CUMS小鼠中，补充EPs恢复了BrdU+GFAP+RGLs的数目(图5H，P = 0.059)。这些结果表明，EPs激活了静止的神经干细胞池(BrdU+GFAP+RGLs)，这有助于增加新生的颗粒细胞数目(BrdU+Prox1+)。
图5. EPs减轻CUMS诱导的海马神经发生缺陷。
讨论
慢性应激引起的肠道菌群失调导致肠道屏障受损和免疫失调，这被认为是抑郁症发病机制的一个驱动因素。多糖通过调节肠道菌群和保护肠道屏障发挥益生元的作用。虽然以前研究表明，EPs表现出抗炎和神经保护作用，但EPs对社会心理应激引起的机体紊乱，特别是肠道菌群失调和随后的炎症反应的影响，还没有被研究过。本研究观察到CUMS增加了应激反应，反映在肠道菌群失调和神经炎症上，而补充EPs则改善了这种情况。此外，我们观察到EPs恢复了CUMS小鼠的神经发生节律并减轻了焦虑和抑郁样行为。下面，我们将讨论这些结果是如何扩展我们对EPs改善慢性应激诱导损伤和潜在机制的理解。
饮食被认为是控制和塑造肠道菌群结构的关键决定因素。不能被宿主消化的膳食多糖到达结肠后被肠道细菌降解，为肠道微环境提供潜在的能量来源。这表明膳食多糖的摄取是一种直接影响细菌种类平衡的策略。本研究的发现更新了我们对EPs改善CUMS诱导的小鼠肠道菌群失调的理解。Chao1指数显示，CUMS显著降低了肠道菌群的多样性。与临床发现一致，与正常个体相比，精神障碍患者的肠道菌群的α多样性明显下降。补充EPs后，CUMS小鼠的肠道菌群的丰富度和多样性明显增加。此外，β多样性分析的结果表明，CUMS塑造了小鼠独特的微生物群落，反映出CUMS对肠道菌群多样性的潜在影响。EPs小鼠的肠道菌群组成与对照组小鼠更为相似，表明EPs对CUMS诱导的肠道菌群失调有改善作用。
研究表明，在动物和人类研究中，Lactobacillus和Bifidobacterium是益生菌的主要细菌属，它们能增强肠道菌群的组成和多样性。此外，益生菌可以与致病菌竞争生长，减少肠道上皮细胞有害细菌数量，进一步减弱黏膜炎症反应，增强肠道屏障功能。我们发现，EPs的补充增加了CUMS小鼠的Lactobacillales和Lactobacillaceae的丰度。这一发现表明，EPs的有益作用可能至少部分是由于这些有益菌群丰度的增加。补充EPs也抑制了参与应激和炎症的几个细菌分类群。例如Proteobacteria，与慢性应激诱导的炎症有关，在补充EPs后减少。此外，本研究发现CUMS小鼠中Prevotellaceae和Lachnospiraceae的相对丰度增加，这一结果也在暴露于CUMS的猕猴中观察到。此外，我们观察到一些肠道共生细菌组成的变化趋势与以前的报道不同。一些研究报告称，Clostridiales和Clostridia的相对丰度与抑郁症和心理应激的严重程度呈负相关。然而，本研究结果表明，慢性应激会增强小鼠Clostridiales和Clostridia的水平。这些差异可能是由于应激相关动物模型的开发方法不同或动物的差异造成的。在本研究中，补充EPs后，CUMS暴露的小鼠中Prevotellaceae、Lachnospiraceae和Clostridiales丰度被逆转，趋势趋向于对照组小鼠。综上，EPs可能是通过调节肠道菌群的组成来减弱CUMS引起的抑郁样表型。
慢性应激可以破坏肠道菌群的组成，继而引发肠道的炎症免疫反应，从而促进结肠炎的发展。同样，本研究中CUMS小鼠表现出明显的结肠炎特征，其特征是MCP-1、iNOS和TNF-α的高活性。MCP-1和iNOS是溃疡性结肠炎的典型炎症指标。此外，TNF-α是IBD发病中的主要炎症因子，直接刺激肠道上皮细胞和先天免疫细胞合成其他炎症细胞因子。
肠道炎症引发了肠道上皮屏障的紊乱，这进一步导致了病原体渗透的增加。同样，在本研究的结果中，ZO-1蛋白水平在CUMS小鼠的结肠中明显下降，表明CUMS诱发了结肠黏膜的损伤。由CUMS诱导的肠道菌群失调引起的肠道渗漏使革兰氏阴性菌(包括Proteobacteria)的产物LPS渗透到血液中，最终导致全身性和靶向性炎症。我们发现，补充EPs可以缓解结肠炎症，增强肠道屏障的完整性，并减少血清中的内毒素。值得注意的是，受CUMS影响的菌群的相对丰度与结肠中的iNOS、TNF-α和MCP-1水平呈正相关，与ZO-1呈负相关，这表明被破坏的菌群在肠道平衡失调中发挥了关键作用。补充EPs的有益影响可能归因于特定肠道菌群的变化(如Lactobacillaceae的生长和Proteobacteria的减少)。
全身炎症对肠道-大脑的交流至关重要。在此，我们观察到CUMS小鼠血清中的LPS水平明显增加，这可能是由肠道菌群的改变和随后的肠道炎症和通透性增加引发的。补充EPs可抑制LPS的释放，从而抑制全身性炎症。肠腔内的LPS与小胶质细胞表面的TLRs结合，引发一个信号级联，诱导促炎症分子的表达。在我们的研究中，CUMS小鼠的海马齿状回中的小胶质细胞被激活，其特征是细胞的复杂性和密度增加，以及形态的过度分支化。以前的一些研究已经证明了TLR4途径在微生物群-肠道-大脑轴中的突出作用。TLR4/NF-κB/MAPK通路激活后，其下游产物如IL-1β和IL-6升高，这在本研究中CUMS小鼠的大脑中被检测到。我们的研究表明，EPs显著降低了血清中的LPS水平，抑制了小胶质细胞介导的TLR4/NF-κB/MAPK信号通路激活和随后的促炎症细胞因子。重要的是，相关性分析显示，海马中促炎细胞因子和蛋白水平与CUMS相关菌群的丰度密切相关。这些结果表明，EPs可能通过重塑肠道菌群来抑制中枢神经系统的炎症。
众多研究表明，在炎症和应激背景下，小胶质细胞的激活是抑制神经发生的关键机制，它们分泌的促炎症细胞因子被认为是神经发生过程不同阶段的调节器。海马是大脑的一个关键区域，特别容易受到促炎症介质的潜在有害影响。例如，过表达IL-6的小鼠表现出海马祖细胞的增殖、分化和存活降低。此外，最近的一项研究表明，在围产期暴露于IL-1β的小鼠在60日龄时表现出神经祖细胞的增殖减少。在脑神经发生过程中，Prox1是颗粒细胞成熟和中间祖细胞维持所必需的。事实上，在慢性应激诱导的神经炎症背景下，我们观察到CUMS小鼠的神经干细胞(BrdU+GFAP+RGLs)数量明显减少，表明CUMS诱导了干细胞池的耗竭，这直接导致了新生颗粒细胞(BrdU+Prox1+)的损失。与对小胶质细胞介导的神经炎症的抑制作用相一致，EPs的补充逆转了CUMS诱导的海马神经发生缺陷。
结论
综上，EPs减轻了CUMS小鼠的抑郁样和焦虑样行为并抑制了神经炎症，这可能部分归因于其对肠道屏障损伤和LPS渗透的预防作用。与此同时，EPs改善了CUMS诱导的海马成体神经发生的缺陷。EPs的这些有益作用可能与它们重塑肠道菌群的功能有关。这项研究支持了潜在的基于营养的新型应激相关疾病治疗靶点的重要性，并表明EPs可能被用作潜在的膳食补充益生元，以重塑肠道菌群，进一步改善相关的行为和生理缺陷。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016503272300602X#s0130
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