英文原题：Interface Engineering of Carrier-Protein-Dependent Metabolic Pathways
供稿人：高瑞，北京大学
大家好，本周为大家介绍一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章，标题为“Interface Engineering of Carrier-Protein-Dependent Metabolic Pathways”。文章的通迅作者是来自美国加州大学圣地亚哥分校化学与生物化学系的Michael D. Burkat教授。
载体蛋白依赖的代谢途径（Carrier-protein-dependent metabolic pathways）是一类生物合成途径，用于合成脂肪酸、多酮类化合物以及非核糖体肽等多种有机分子，产生具有重要药物、环境以及工业应用的代谢产物。在生物体系中，这类代谢物合成路径需要依赖特定的载体蛋白携带代谢合成的中间产物，并通过蛋白质-蛋白质相互作用来将中间产物从一种合成酶传递到另一种合成酶，从而实现代谢产物合成的有序调控。而通过人为的手段对这些途径中的蛋白质相互作用进行改造，就可以对整个代谢途径进行重新设计与调控，甚至实现非天然产物的生物合成。
为了实现这一目的，需要对载体蛋白与酶之间发生相互作用的界面进行改造，从而使得本来并不匹配的载体蛋白与合成酶形成新的相互作用，实现功能获得的活性，从而改变后续的产物合成。在本篇工作中，作者团队开发了计算机辅助的蛋白质-蛋白质相互作用界面设计与改造流程，通过结合Rosetta等软件对蛋白质互作界面的设计预测以及实验的表征，期望实现新的载体蛋白与酶之间的相互作用介导的非天然代谢物的合成。
本文首先选择了一种在荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）中参与到藤黄绿脓菌素（pyoluteorin）合成的二型非核糖体肽合成酶的腺苷酰化结构域蛋白PltF。依赖于ATP的作用，PltF蛋白可以活化并招募L-脯氨酸，将其结合到下游互作的载体蛋白PltL的巯基上，从而介导下游的后续合成过程。由于近期有工作对PltF与PltL蛋白的结构以及它们之间的相互作用界面进行了高分辨率的解析，本文于是选择这一对相互作用作为新蛋白质相互作用设计的示例。他们随后选择了大肠杆菌中的脂肪酸合成的酰基载体蛋白AcpP，在天然的合成路径中，AcpP同样携带着上游蛋白所介导连接在其巯基上的脂肪酸中间体分子，并进行下游的脂肪链延长或者修饰反应并最终得到脂肪酸产物。在脂肪酸的合成途径中，AcpP的底物携带作用十分关键，这也使得它成为进行非天然脂肪酸合成设计中的重要目标蛋白。
图1. PltF蛋白所参与的天然代谢产物合成途径与本文所设计的改造下游蛋白质相互作用界面所实现的非天然脂肪酸分子合成途径。天然情况下，PltF蛋白结合L-脯氨酸并通过与下游PltL蛋白形成相互作用将脯氨酸转移到PltL蛋白上，从而介导下游的合成；在本文的设计中，通过改造PltF上本来与PltL产生相互作用的界面，可以实现PltF与本来没有相互作用的AcpP蛋白发生结合，从而使L-脯氨酸参与到AcpP后续的脂肪酸分子合成途径中，最终产生非天然的脯氨酸脂肪酸。
通过对结构的分析，作者团队发现AcpP蛋白与PltL蛋白享有27%的结构相似度，但是为了在进行结构突变设计时对下游的合成途径产生不必要的影响，他们决定通过改造PltF的结构来实现两者间的相互作用。在Rosetta的算法软件设计中，他们集中在距离相互作用界面8Å以内的氨基酸残基，并保留PltF中与催化活性相关的K402与K486位点。
图2. 计算与实验相结合的蛋白质互作界面设计流程。基于PltF与AcpP间互作界面的突变体被用于计算机以及体外实验进行评估，两者间相互提供信息进行结构设计的优化。
在全部生成的突变中，有六个位点的突变在体外实验中展现了与AcpP更强的相互作用，但随之进行了六者间组合的双突变与三突变体并没有显著地增强这一对相互作用。因此，作者将这六个单点突变继续进行后续轮次的Rosetta设计，期待找出可以在单点突变基础上进一步增强相互作用的新突变位点。在三轮的突变设计后，得到的Q438R K472R D263N三突变体可以实现体外实验中对AcpP进行83%水平的脯氨酸结合活性，这相较与野生型的PltF蛋白提高了182倍。
图3. 对三轮突变设计中得到的PltF突变体蛋白进行体外实验表征其与AcpP结合并转移L-脯氨酸的活性。每轮中紫色突变体代表被选择进行下一轮设计优化的突变体。
在通过体外实验表征了突变体活性增强后，作者通过结构预测对两个蛋白间的相互作用进行了研究。在先前所解析的PltF与PltL间天然的相互作用中，两者间的互作界面主要通过疏水性相互作用结合；而当将AcpP与PltL进行结构叠加预测时，发现PltF的互作界面需要通过形成盐桥与AcpP产生相互作用，而三轮计算设计的三突变体Q438R D263K A230R恰好通过引入更多正电荷残基的方式，既增加了互作界面口袋中的正电荷整体分布，又增加了潜在的可以与AcpP形成盐桥的位点，这就从结构基础上解释了为什么三轮设计后的突变体可以实现更强的相互作用与活性。
图4. 野生型与突变体间蛋白质相互作用界面的比较。（A）与（B）图分别代表野生型PltF与三突变的PltF与AcpP蛋白的相互作用分子对接模拟。（C）与（D）则代表两者间静电势的差别。
最后，本文还进行了NMR滴定的实验，用以表征野生型和突变型PltF与AcpP间的蛋白质相互作用。结果显示野生型的PltF蛋白没有表现出明显的化学位移扰动，这也符合其在天然情况下不与AcpP产生相互作用的预期；而三突变体的PltF蛋白则有10个位点表现出了明显的化学位移扰动，这10个位点也都分布在两者的预测相互作用界面上，其中产生最强扰动的D38位点更是预测会与AcpP之间形成盐桥。
图5. PltF与AcpP间的NMR滴定实验。与野生型PltF蛋白相比，本文所设计的突变体蛋白展现出多个位点明显的化学位移扰动，这些位点被证明大多分布于两者间的相互作用界面上。
总而言之，本篇工作通过计算机设计与体外实验相结合的方式，对载体蛋白依赖的代谢合成途径中的蛋白质相互作用界面进行了设计与改造。在对非核糖体肽合成酶的结构进行改造后，使其可以与脂肪酸酰基载体形成新的相互作用，从而实现两种代谢合成通路的杂交，完成对非天然脯氨酸脂肪酸产物的生物合成。基于这种方法，在未来更多种类的非天然产物的生物合成有望被实现。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
