英文原题：A NAD(P)H Activated Fluorescent Probe for Rapid Intra-operative Pathological Diagnosis and Tumor Histological Grading
通讯作者：王琦、冀海伟、吴丽，南通大学公共卫生学院，南通市公共健康与医学分析重点实验室
作者：Chaojie Yang (杨超杰), Chenxia Jiang (姜晨霞), Majun Yang (杨马骏), Qingqing Bai (白庆庆), Yaya Zhen (甄亚亚), Yuxue Zhang (张愉雪), Weiyi Yin (殷伟毅), Jian Wang (王健), Xiaobo Zhou (周晓波), Guo Li (李国), Mingmin Wu (吴铭敏), Yuling Qin (秦玉岭), Qi Wang* (王琦), Haiwei Ji* (冀海伟), Li Wu* (吴丽)
背景介绍
快速、准确的术中病理诊断对于医师的术中决策以及改善患者预后，避免再手术至关重要。术中冷冻切片H&E染色是一种临床可靠的方法被广泛应用于术中病理诊断。然而，现有的诊断方法有明显的局限性，如缺乏经验丰富的病理医生、切片取样误差、冰晶伪影、缺乏特殊病例的研究、切片易受酶消化影响且检测过程繁琐、耗时长久等。因此，开发一种通用检测方法能快速、准确地鉴别肿瘤组织和正常细胞，同时实现肿瘤组织学分级鉴定对临床一线病理医生，特别是对基层医院病理诊断具有重要意义。
文章亮点
近日，南通大学吴丽教授团队在 Chemical & Biomedical Imaging上发表了一篇关于荧光探针用于临床术中快速病理诊断及肿瘤组织学分级鉴定的研究。小分子荧光探针由于可以很容易进入细胞或组织，能以高分辨、可视化信号实时动态监测目标化合物并实现其原位定量分析，在肿瘤的研究中发挥不可替代的作用。NAD(P)H作为一种广谱代谢标志物参与细胞各种生化反应，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。如肿瘤细胞为满足自身生长出现Warburg效应，使得NAD(P)H产生增多，并且分化程度越低，升高越明显。因此，实现细胞或组织中NAD(P)H的精确检测对肿瘤的快速鉴定及组织学分级具有重要意义。
图1. (A)NAD(P)H探针分子结构；(B)探针分子与NAD(P)H反应机理图；(C)CyQ-1与NAD(P)H(0-14 mM)反应吸收和荧光发射图；(D)CyQ-1的检测特异性研究(1) blank; (2) Na+; (3) K+; (4) Ca2+; (5) Fe3+; (6) Mg2+; (7) Fe2+; (8) 丙酮酸; (9) 葡萄糖; (10) 果糖; (11) 酪氨酸; (12) 亮氨酸; (13) 丙氨酸;(18) NADPH; (19) NADH(1-7: 1 mM; 8-13: 100 mM; 14-15: 20mM)。
基于此，作者利用不同细胞NAD(P)H代谢的差异，设计了系列小分子荧光探针用于肿瘤细胞的鉴定及组织学分级。如图1所示，探针CyQ-1能特异性响应NAD(P)H，且具有灵敏度高，检测限低、响应快等优点。通过和商业化线粒体绿色荧光探针对比以及探针对不同化合物刺激下细胞内NAD(P)H浓度的灵敏检测实验证明CyQ-1具有较好的光稳定性和检测灵敏度，能够应用于生物细胞NAD(P)H的检测。荧光显微镜成像和流式细胞仪检测结果显示探针对于不同分化程度的肿瘤细胞(Hela、A549、MDA-MB-231、4T1、MCF-7、HePG2)以及正常细胞(HUVEC和HL-7702)有明显的区分能力。作者进一步将该探针用于临床病理组织石蜡切片成像，发现探针对乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺腺癌、肺鳞癌、甲状腺癌、上颌窦癌等均有响应，表明该探针具有检测广谱性。
作者进一步探究了该探针对临床结直肠癌的分级鉴定能力，通过对合作医院病理医生收集的120例不同分化结直肠癌样本连续切片的H&E染色和CyQ-1探针荧光成像分析，低分化结直肠癌石蜡切片荧光响应信号较强；中分化、高分化，正常组织切片荧光信号出现依次降低，该结果与不同分化肿瘤细胞中NAD(P)H含量特征相符合（图2）。作者利用统计学分析获得了利用CyQ-1荧光探针区分低、中、高分化结直肠癌及正常肠组织的95%置信区间，并利用该方法测算了探针在结直肠癌分级鉴定中的灵敏度和特异性。结果显示，该新型探针对临床结直肠癌石蜡切片具有较高的检测高灵敏度（92.2%）和特异性（93.3%）。值得注意的是，作者通过石蜡切片CyQ-1和DAPI染色两个荧光通道的比值进一步降低了检测设备所导致的系统误差，提高了检测的准确率。
图2. 120例临床直肠癌石蜡切片检测及统计学分析。(A)120例不同病理分级的结直肠癌石蜡切片H&E、CyQ-1、DAPI染色图。(B)120例结直肠癌石蜡切片CyQ-1和DAPI染色及其平均荧光强度比值（MFICyQ-1/MFIDAPI）图。(C)120例结直肠癌石蜡切片CyQ-1染色平均荧光强度的分布图。(D)石蜡切片检测敏感性和特异性分析。(E)结直肠癌石蜡切片的统计学分析。
作者进一步收集了20例不同分化程度的肺癌术中冷冻切片，并对切片进行了同样的固定和CyQ-1、DAPI染色。图3中荧光成像图显示，低分化冷冻切片具有最高的平均荧光强度。随着肿瘤恶性程度的降低，平均荧光强度出现了显著的下降。统计学分析显示，通过平均荧光强度或CyQ-1/DAPI两个通道荧光强度的比值都能较好的区分不同分化的肺癌肿瘤，且准确度、敏感性和特异性都达到了100%。由于临床术中冷冻切片的诊断未经石蜡包埋，因此术中快速诊断对临床病理医生来说更具有挑战性。这进一步突显了CyQ-1在临床冷冻切片诊断中的应用潜力。
图3.20例临床肺癌冷冻切片CyQ-1荧光成像及统计分析。(A)低、中、高分化肺癌及正常肺组织冷冻切片CyQ-1染色荧光成像图。(B) 20例肺癌冷冻切片CyQ-1和DAPI染色及其平均荧光强度比值（MFICyQ-1/MFIDAPI）图。(C)冷冻切片检测敏感性和特异性分析。(D)肺癌冷冻切片的统计学分析。
临床石蜡切片和冷冻切片检测结果表明，CyQ-1荧光探针可以作为一种临床有效辅助诊断方法实现结直肠癌以及肺癌快速诊断以及病理组织学分级。
总结/展望
综上所述，南通大学吴丽研究团队通过一种高灵敏度、NAD(P)H响应荧光”turn on”型小分子探针实现了肿瘤细胞和组织中NAD(P)H的快速检测。临床120例结直肠癌石蜡切片和20例肺癌冷冻切片检测结果统计学分析显示该探针能有效区分肿瘤细胞和正常细胞中NAD(P)H的含量，并且能通过有效检测阈值实现不同肿瘤的组织学分级鉴定。接下来作者希望通过一系列肿瘤代谢组学荧光探针的构建，结合人工智能实现肿瘤代谢途径中的关键代谢物的实时、动态高分辨解析，以实现肿瘤的早期诊断和治疗。
相关论文发表在高质量期刊Chemical & Biomedical Imaging上，南通大学硕士研究生杨超杰、杨马骏以及南通大学附属医院姜晨霞为文章的第一作者， 王琦、冀海伟及吴丽教授为通讯作者。
通讯作者信息
吴丽 教授
个人简介：国家级青年人才计划及江苏省杰出青年基金入选者，江苏特聘教授，南通大学教授，博士生导师。2015年毕业于中国科学院大学长春应用化学研究所。2015-2019年在美国华盛顿大学生物医学工程系从事博士后研究。现为南通大学公共卫生学院教授。迄今已发表发表SCI论文70余篇，论文他引6000余次，h-index为35。以第一作者及通讯作者身份在Chem. Soc. Rev., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Adv. Mater., Adv. Funct. Mater.等国际著名学术期刊发表论文40余篇，其中有4篇论文入选“ESI Highly Cited Paper”，1篇论文荣获2013年度“中国百篇最具影响国际学术论文”，另有多篇论文入选封面论文。授权美国专利1项、中国专利2项。主要研究方向为新型生物医学检测技术，单细胞分离分析，荧光共聚物量子点及其生物医学应用等。目前主持国家自然科学基金项目两项。
主页链接：
https://gw.ntu.edu.cn/wulab/
王琦 副教授
个人简介：南通大学医学检验系副教授，四川省特聘专家，美国斯坦福大学访问学者，复旦大学博士。从事细胞代谢监测、蛋白质组学与成像新技术研究。到目前为止，在Chemical Society Reviews, Analytical Chemistry, Theranostics, Advanced Materials, Chemical Communications等杂志上共发表论文三十余篇，申请国家专利8项，授权4项，转化1项。受邀担任Analytical Chemistry, Chemical Science, Chemical Communications等期刊审稿人。近年来主持及参与国家自然科学基金各一项，参与科技部重大研究计划973项目一项并获国家留学基金委资助于美国斯坦福大学研修。
冀海伟 校聘教授
个人简介：南通大学医学检验系校聘教授，2017年博士毕业于长春应用化学研究所无机化学专业，师从国家杰青曲晓刚教授。主要研究方向：生物纳米功能材料，多功能纳米传感体系的设计及应用，生物电化学。目前主持国家自然科学基金面上项目1项，参与4项，发表SCI论文38篇，其中第一/通讯作者13篇，他引>1335次，申请发明专利7项。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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