Nat Chem Biol | 上海科技大学季泉江等团队揭示Cas12f1的工作机制

CRISPR-Cas12f核酸酶是目前最小的基因组编辑器之一，显示出通过负载大小有限的腺相关病毒运载工具有效递送的优势。大多数已知的Cas12f核酸酶识别类似的T-rich原间隔邻近基序(PAMs)用于DNA靶向，这极大地限制了它们的靶向范围。

2023年9月11日，上海科技大学季泉江及Wu Zhaowei共同通讯在Nature Chemical Biology 在线发表题为“Molecular basis and engineering of miniature Cas12f with C-rich PAM specificity”的研究论文，该研究解析了微型基因编辑系统CRISPR-CnCas12f1的三元复合体的结构，揭示了其独特的结构特征与其识别C-rich PAM并发挥催化作用的分子机制，并通过工程化改造向导RNA，将最初没有编辑活性的CnCas12f1转化为人类细胞中高效的基因编辑工具。

结构表征揭示了详细的PAM识别，不对称二聚体形成和小向导RNA (sgRNA)关联机制。sgRNA工程将最初在细菌中无法靶向基因组的CRISPR-CnCas12f1转化为人类细胞中有效的基因组编辑器。该研究有助于进一步了解CRISPR-Cas12f1的工作机制，并扩展mini-CRISPR工具箱。

大多数古生菌和许多细菌都配备了CRISPR和Cas系统，它们作为适应性免疫系统抵御入侵的核酸。CRISPR-Cas系统目前分为2类(1类和2类)、6类(I-VI)和30多个亚型。1类系统涉及一个多蛋白效应复合物，而2类系统，包括II型(Cas9)、V型(Cas12)和VI型(Cas13)，使用单个多结构域效应Cas蛋白进行核酸干扰。2类效应器(如Cas9)的效应器组成简单，Cas12a和Cas13a核酸酶，已经使它们的工程作为多种应用的通用基因编辑器。然而，这些Cas核酸酶的大尺寸，其中大多数超过1000个氨基酸(aa)，阻碍了广泛使用的货物大小有限的递送工具的有效递送，极大地限制了它们在体内的编辑应用。

近年来，已发现并鉴定了CasX (Cas12e，<1,000 aa)11、Cas12f(以前称为Cas14, 400-700 aa) 12-17、Cas12i(≈1,000 aa) 18-21、Cas12l (~860 aa)22、Cas12j (CasΦ， 700-800 aa) 23-25、Casλ (747 aa)26、TnpB (~400 aa)和IscB (~400 aa) 等紧凑型CRISPR核酸酶和祖先蛋白。然而，大多数紧凑核酸酶在哺乳动物细胞的自然形态中仅表现出较低或最低的基因组编辑能力。核酸酶和向导RNA工程的最新进展已将CRISPR-Cas12f1转化为细菌和哺乳动物细胞中的高效基因组编辑器。

Cas12f1在结构上被表征为向导RNA和靶DNA结合的二聚体蛋白，这为基于Cas12f1的基因组编辑的分子工程提供了基础。有趣的是，大多数已表征的Cas12f1核酸酶的靶向范围非常有限，因为它们严格识别富含T的原间隔物邻近基序(PAMs)。一种来自诺氏梭状芽孢杆菌的Cas12f1核酸酶(CnCas12f1)已被证明具有罕见的C-rich PAM特异性。然而，没有观察到该核酸酶的基因组靶向或基因组编辑活性，CnCas12f1靶向DNA和PAM识别的相关机制仍然未知。

CnCas12f1-sgRNA-dsDNA三元配合物的整体结构（图源自Nature Chemical Biology ）

该研究确定了CnCas12f1与小向导RNA (sgRNA)和含有ACCT PAM的靶双链DNA (dsDNA)复合物的冷冻电镜结构。该复合物结构揭示了一种详细的稀有C-rich PAM识别机制以及两种CnCas12f1单体的不对称二聚化激活的sgRNA和dsDNA结合机制。CnCas12f1和Un1Cas12f1的结构比较突出了Cas12f1酶的结构多样性。此外，作者系统地优化了CnCas12f1 sgRNA，在人类细胞中创建了一个具有更高基因组编辑活性的工程sgRNA。该研究进一步了解了Cas12f1的工作机制，有助于CnCas12f1核酸酶的合理工程，丰富了具有罕见PAM特异性的微型CRISPR-Cas工具箱。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41589-023-01420-4

转自：“iNature”微信公众号

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