导读
雷公藤多苷片（TGT）是雷公藤中最常见的制剂，广泛用于临床治疗类风湿性关节炎（RA）和其他自身免疫性疾病。然而，其严重的生殖毒性限制了其应用。本研究旨在阐明TGT对雄性RA大鼠生殖系统的毒性作用及其潜在的毒性成分和机制。我们建立胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，给予低、中、高剂量TGT混悬液。性腺指数、病理变化和生精细胞数量用于评估TGT对生殖系统的毒性作用。睾丸组织的非靶向代谢组学通过超高效液相色谱飞行时间质谱（UHPLC-QTOF/MS）进行。结合网络毒理学，我们筛选了TGT诱导生殖毒性的关键靶点，并使用RT-qPCR进行验证。我们还使用睾丸间质细胞（TM3）和正常小鼠睾丸Sertoli细胞（TM4）细胞系评估了19种TGT成分的体外毒性。分子对接被用来预测有毒成分和关键靶点之间的相互作用。结果发现，TGT降低了睾丸和附睾的重量。病理分析显示大量生精小管变形和萎缩。生精细胞数量显著减少（P＜0.0001）。睾丸代谢组学鉴定了58种不同的代谢产物，包括血小板活化因子（PAF）、溶血磷脂酰胆碱（Lyso PC）、磷脂酰肌醇（PI）、谷胱甘肽（GSH）和腺苷一磷酸（AMP）。甘油磷脂代谢、醚脂代谢和谷胱甘肽代谢是导致TGT生殖毒性的关键途径。网络毒理学筛选了10个关键的生殖毒性靶点。细胞毒性试验表明，雷公藤甲素、雷藤酮、雷公藤红素和去甲泽拉木醛可显著降低TM3和TM4细胞的活力。生物碱没有明显的毒性作用。分子对接表明，这四种毒性成分与10个关键靶点具有良好的亲和力。所有的结合能都小于-7 Kcal/mol。RT-qPCR结果显示Cyp19a1水平显著上调。Pik3ca和Pik3cg水平显著下调。通过睾丸代谢组学，我们发现TGT可能通过CYP19A1、PIK3CA和PIK3CG三个靶点引起生殖毒性。本研究为阐明TGT的毒性机制、评价其安全性和质量奠定了基础。
研究热点：
1. 用UHPLC-Q-TOF/MS从睾丸中鉴定出58种毒性差异代谢物；
2. 甘油磷脂代谢、醚脂代谢和谷胱甘肽代谢是TGT诱导生殖毒性的关键途径；
3. 利用TM3和TM4细胞系评估TGT中19种成分的细胞毒性；
4. CYP19A1、PIK3CA和PIK3CG是TGT生殖毒性的潜在靶点。
论文ID
原名：Toxic effects of Tripterygium glycoside tablets on the reproductive system of male rats by metabolomics, cytotoxicity, and molecular docking
译名：通过代谢组学、细胞毒性、分子对接研究雷公藤多苷片对雄性大鼠生殖系统的毒性作用
期刊：Phytomedicine
IF：7.9
发表时间：2023.04
通讯作者：王巧
通讯作者单位：河北医科大学药学院
实验设计
实验结果
1. 内脏指数及组织学结果
如图1A-B所示，与模型组相比，中剂量（TGT-M）和高剂量（TGT-H）组的睾丸和附睾重量显著降低（P<0.0001）。图1D显示了睾丸和附睾组织的外观。模型组睾丸被膜表面光滑。TGT处理后，睾丸出现褶皱，白膜表面不太光滑，白膜不规则增厚，尤其是TGT-M和TGT-H组。各组附睾无明显差异。
HE染色显示对照组曲精小管形态正常，生精细胞丰富且排列良好（图2）。在一些小管的中心可以看到成熟的精子。模型组生精细胞稀疏分布于曲精小管内。与模型组相比，TGT-L组睾丸组织恢复良好。随着剂量的增加，TGT-M和TGT-H组睾丸损伤加重。生精小管发生变形和萎缩，生精小管之间的空间变大。生精细胞数量显著减少（P＜0.0001）（图1C）。管腔内很少有成熟的精子。特别是在TGT-H组中，生精细胞分散且无组织。
图1 睾丸和附睾指数（A-B）。生精细胞的数量（C）。各组睾丸和附睾的形态学（D）。与模型组相比，*p＜0.05，***p＜0.0001。
2. 基于LC-MS的睾丸代谢组学分析
我们使用无监督PCA模型观察样本之间的真实分布，其中每个点的距离表示样本的相似性。点之间的距离表示样本的相似性。如图3A-B所示，两个QC样本在PCA评分图中大量聚集，表明分析条件在整个过程中是稳定的。与对照组相比，模型组的代谢谱完全重叠，表明模型很少影响睾丸代谢产物。随着剂量的增加，与模型组相比，可以看到明显的分离趋势，表明代谢物受到了显著的干扰。
图2 各组睾丸H&E染色(200 ×)
OPLS-DA模型用于筛选模型组和给药组之间的差异代谢物（图3C，E）。我们进行了200次置换检验和从CV-ANOVA获得的p值，以评估OPLS-DA模型的准确性和可信度（图3D，F）。结果如表2所示。R2Y和Q2值均大于0.5，P值<0.05表明OPLS-DA模型具有良好的解释率和预测能力。模型与TGT-L之间存在过度拟合。此外，P>0.05表明低剂量给药后睾丸代谢产物没有显著紊乱，这与PCA结果一致。因此，我们仅选择TGT-M和TGT-H组来筛选毒性差异代谢物。
图3 睾丸样本的多变量统计分析
正离子和负离子模式下的主成分分析得分图（A和B）；在ESI+模式（C和D）和ESI-模式（E和F）中，不同组的OPLS-DA得分图和200个置换检验。
满足VIP>1、P<0.05、FC≥1.2或FC≤0.8条件的化合物被认为是差异代谢产物。与模型组相比，TGT-M和TGT-H组鉴定出58种代谢产物。表3列出了58种代谢物的信息。我们将从不同剂量组获得的差异代谢物分别导入MetaboAnalyst 5.0进行通路分析。与模型组相比，TGT-M组和TGT-H组分别获得了6条和3条P<0.05的通路。甘油磷脂代谢、醚脂代谢和谷胱甘肽代谢是共同的代谢途径，表明TGT对雄性生殖系统的毒性作用主要通过这3种途径调节（图4）。
图4 睾丸组织中差异代谢物的通路分析
(A:模型vs TGT-M；B:模型vs TGT-H)
3. 生殖毒性靶点的获取
根据之前的研究和其他文献，我们收集了27种TGT的体内成分。基于27种成分的结构，我们通过Swiss Target Prediction获得551个靶点，从PharmMapper预测78个靶点。我们将从两个数据库中获得的靶点合并并且去除重复靶点，共收集576个靶点。
包括GeneCard和CTD在内的两个数据库用于检索生殖毒性靶点。最终，我们获得1106个靶点。
Metscape用于挖掘与内源性分子相关的潜在靶点。我们将58种差异代谢产物导入Cytoscape。根据化合物反应酶基因网络，获得了306个与代谢产物相关的靶点。（图5A）。
表1 引物序列
上述三部分的交叉被认为是TGT诱导生殖毒性的核心靶点。最后我们获得了10个核心靶点（图5B），包括磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基（PIK3CA，PIK3CG）、谷胱甘肽还原酶（GSR）、芳香化酶（CYP19A1）、cAMP特异性3′，5′-环磷酸二酯酶4D（PDE4D）、醛酮还原酶家族1成员A1（AKR1A1）、腺苷脱氨酶（ADA）、细胞色素P4503A4（CYP3A4）、谷胱甘肽S-转移酶Mu 1（GSTM1）和细胞色素P4502C9（CYP2C9）。
表2 正负离子模式下的OPLS-DA模型参数
图5 基于Metscape的差异代谢物的潜在靶点（A）。交叉靶点的维恩图（B）。
4. 细胞毒性筛选
从TGT中提取的19种商业可购买成分用于毒性测试。随着药物浓度的增加，19种成分表现出不同的细胞毒性。表4总结了IC50。
表3 UHPLC-MS鉴别差异代谢物
4种成分显著降低了细胞活力（图6A）。雷公藤甲素在TM3和TM4细胞中均表现出最强的细胞毒性，其IC50分别为38.23 nM和63.96 nM。随后是雷藤酮对TM3的IC50为107.8 nM、对TM4的IC50是254.7 nM。雷公藤红素和去甲泽拉木醛表现出中度细胞毒性。雷公藤红素在TM3和TM4中的IC50分别为1.645μM和2.33μM。去甲泽拉木醛在TM3中的IC50为13.23μM，在TM4中为10.77μM。
表4 不同成分对TM3和TM4细胞的IC50值
3种成分对细胞有轻微毒性作用。当雷公藤吉(晋)碱和雷公藤次碱的浓度达到100 μM时，TM3细胞不受影响，但TM4细胞的相对活力下降到60%（图6B）。雷酚内酯对两种细胞系都有温和的影响。当浓度达到100μM时，TM3的相对活力降至70%，TM4降至80%（图6C）。
图6 （A）用雷公藤甲素（a）、雷藤酮（b）、雷公藤红素（c）和去甲泽拉木醛（d）处理的TM3和TM4细胞的存活曲线。（B）雷公藤吉(晋)碱和雷公藤次碱对TM3和TM4细胞活力的影响。（C）雷酚内酯对TM3和TM4细胞活力的影响。（D）不同成分对TM3（a）和TM4（b）细胞活力的影响。与0μM相比，***P＜0.001和***P＜0.0001。
12个成分，包括雷公藤乙素、雷公藤福定、新雷公藤福定、雷公藤内酯甲、野鸦椿酸、雷公藤三烯酸A、hyponine E、hyponine D、peritassine A、雷公藤春碱、雷公藤碱和雷公藤新碱，对这两种细胞几乎没有影响，在最大浓度下细胞的相对存活力约为90%（图6D）。
图7 不同成分和靶点之间的对接样式
5. 分子对接
我们进行分子对接以验证有毒成分是否能结合核心靶点。从细胞毒性中筛选出的4种毒性成分与10个核心靶点对接，结合能大小被用来评估对接结果。如果结合能小于0，则配体可以自由地与受体结合；结合能小于-5 kcal/mol，表明该成分与靶蛋白具有良好的结合活性。如表5所示，所有的结合能都小于−7 kcal/mol，表明这些成分与靶点之间具有很强的亲和力。
表5 不同靶点和成分之间的结合能
为了观察小分子与靶点的相互作用，我们关注了具有更好结合能（小于−9 kcal/mol）的对接结果。氢键是小分子和靶点之间的主要结合力。对于雷公藤甲素和雷藤酮，所有靶点都与C3，4-位内酯环中的羰基形成氢键（图7A-I）。对于雷公藤红素和去甲泽拉木醛，所有靶点都与A/B环上的基团形成氢键（图7J-R）。这4个成分的结构如图8所示。
图8 雷公藤甲素、雷藤酮、雷公藤红素和去甲泽拉木醛的化学结构
6. mRNA相对表达量
如图9所示，与模型组相比，TGT-M组的Cyp19a1显著上调。与模型组相比，TGT-L和TGT-M组的Pik3ca和Pik3cg均显著下调。TGT-L和TGT-M中Pde4d、Ada、Gsr、Gstm1和Akr1a1的水平与模型组无统计学差异。
图9 Cyp19a1（A）、Pik3ca（B）、Pik3cg（C）、Pde4d（D）、Ada（E）、Gsr（F）、Gstm1（G）、Akr1a1（H）的相对表达。与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001。
讨论
本研究旨在通过代谢组学、网络毒理学、细胞毒性试验和RT-qPCR来阐明TGT对雄性生殖系统的毒性作用，以探索潜在的毒性成分和机制。
我们通过睾丸代谢组学鉴定了58种毒性差异代谢产物，包括PC（O-16:0/2:0）、lysoPC、谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），主要涉及甘油磷脂代谢、醚脂代谢和谷胱甘肽代谢途径。PC（O-16:0/2:0），也称为血小板活化因子（PAF），是缺血性损伤的生化标志物。在本研究中，TGT给药后PAF水平显著上调，表明TGT可能导致缺血性睾丸损伤。LysoPC是一类来源于甘油磷脂（GPL）的脂质分子，可用于评估人类和动物精子的质量。质膜受损的精子中LysoPC含量增加，破坏了顶体反应的生理时间。在本研究中，我们发现TGT给药后各种LysoPC如LysoPC（17:0）和LysoPC（0:0/16:0）的水平显著上调，表明TGT干扰了甘油磷脂代谢，降低了精子质量，从而影响了精子的顶体反应。谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）是最常见的氧化还原组合。在正常生物体中，GSH水平远高于GSSG，但GSH很容易通过暴露于自由基或活性氧（ROS）而被氧化为GSSG。本研究中TGT给药后GSSG水平远高于GSH，表明睾丸组织中产生了大量的ROS，导致氧化应激并对睾丸造成损伤。
我们利用代谢组学和生物信息学，筛选了10个靶点，并通过RT-qPCR进行了验证。由于大剂量给药后毒性明显，TGT-H组睾丸严重萎缩，样本不足。因此，我们只在对照组、模型组、TGT-L组和TGT-M组中进行了RT-qPCR。PIK3CA和PIK3CG属于磷酸肌醇3-激酶（PI3K）调节亚基的不同亚型。它们都可以磷酸化磷脂酰肌醇（PI），随后参与PI3K-AKT信号通路的传导。PI3K-AKT通路的激活可以促进支持细胞的增殖和抗凋亡。在本研究中，代谢组学显示，TGT给药后PI水平显著升高，表明PI磷酸化产物减少，这可能归因于PI3K的抑制。RT-qPCR结果显示Pik3ca和Pik3cg水平显著下调，这进一步证实了我们的观点，即TGT抑制PI的磷酸化，导致PI3K-AKT信号通路阻断，从而抑制支持细胞的增殖和抗凋亡。CYP19A1广泛分布于睾丸、乳腺、前列腺、肝脏等组织中。它可以将睾丸组织中的睾酮转化为雌二醇。适量的雌二醇对维持正常的男性生殖功能至关重要，然而，过量的雌二醇会促进睾丸巨噬细胞的吞噬作用，并影响精子的生成。在过表达CYP19A1的转基因小鼠中，研究者们还观察到生精小管扭曲、Leydig细胞肥大和增生以及精子活力降低。在本研究中，暴露于TGT后，睾丸组织中Cyp19a1的mRNA水平显著升高，表明TGT促进芳香化酶的表达，从而导致雌激素过量和雌激素与雄激素比例失衡，影响精子发生。PDE4D是一种磷酸二酯酶，可将第二信使cAMP水解为AMP。抑制磷酸二酯酶活性可以增加cAMP含量，增强精子活力。在这项研究中，尽管代谢组学没有检测到cAMP，但我们发现TGT给药后AMP水平显著上调，推测TGT促进了PDE4D的水解活性。RT-qPCR结果显示，随着剂量的增加，Pde4d水平呈上升趋势。这表明TGT可能促进PDE4D的表达，导致cAMP的减少和可激活精子运动的信号紊乱。CYP3A4是人类肝微粒体中最丰富、最重要的代谢酶，它不仅代谢外源性药物，还代谢睾酮等内源性化合物。CYP3A4活性的降低导致睾酮合成的反馈降低。研究表明，Arg105、Arg106、Arg372和Glu374是CYP3A4结合口袋中与抑制剂相互作用的关键残基。在这项研究中，我们观察到四种有毒成分与一种或多种上述残基相互作用（图7C、H、M、R）。此外，雷公藤甲素和雷公藤红素已被证明是CYP3A4的抑制剂。据推测，这四种成分通过抑制CYP3A4活性导致睾酮合成的反馈减少，从而导致生殖毒性。这些靶点为我们随后对TGT生殖毒性机制的研究奠定了基础。
人们普遍认为，药物通过与靶蛋白相互作用产生活性/毒性作用。通过细胞毒性试验，我们发现雷公藤甲素、雷藤酮和去甲泽拉木醛对TM3和TM4细胞的活力有很强的毒性作用。毒性最强的雷公藤甲素和雷藤酮是三环氧乙烷型二萜，但同类型的雷公藤乙素没有毒性。从结构的角度来看，我们发现它们的结构差异只是雷公藤乙素在C1位置有一个羟基。分子对接表明，小分子中连接不饱和基团的不饱和基团或羟基易于与蛋白质形成氢键，如雷公藤甲素和雷藤酮中C3、4位内酯环中的羰基（图7A-I）。这表明，雷公藤乙素的无毒性可能是由于在C1的OH基团和C3的羰基之间形成了分子内氢键，这使得其难以与靶蛋白结合以发挥作用。雷公藤红素和去甲泽拉木醛属于木栓烷型三萜，A环和B环都含有多个不饱和基团。其他类型的三萜不具有这种结构特征，很难与靶蛋白形成氢键，然后产生毒性作用。补充材料中提供了所有成分的结构（图S1-S2）。我们需要进一步研究结构和毒性之间的关系。此外，传统细胞系和原代细胞并不相同，对某些药物的毒性敏感性也不同。我们还将使用原代Sertoli细胞和Leydig细胞进行后续验证，以全面探索TGT对雄性生殖系统的毒性作用。
在这项研究中，我们首次使用睾丸代谢组学来研究TGT的生殖毒性，并发现TGT可以通过PIK3CA、PIK3CG和CYP19A1三个靶点对雄性生殖系统造成毒性。值得注意的是，与正常组相比，模型组的睾丸和附睾指数发生了变化。研究表明，RA患者的血清睾酮水平远低于正常男性。RA是一种自身免疫性疾病，雄激素是天然的免疫抑制剂，这表明生殖和免疫之间有着密切的相关性。这一点值得进一步研究。
结论
本研究结合代谢组学、网络毒理学、细胞毒性分析、分子对接和RT-qPCR，研究了TGT对雄性生殖系统的毒性作用，并探讨了可能的机制。睾丸代谢组学显示，TGT给药后，PAF、LysoPC、PI、GSH和AMP等58种代谢产物发生了显著变化，主要涉及甘油磷脂代谢、醚脂代谢和谷胱甘肽代谢。TGT可能通过这三种途径对雄性生殖系统产生毒性作用。19种成分的细胞毒性表明，二萜类化合物（雷公藤甲素和雷藤酮）毒性最大，其次是三萜类物质（雷公藤红素和去甲泽拉木醛），生物碱毒性最小。雷公藤甲素、雷藤酮、雷公藤红素和去甲基泽拉木醛可能通过与PIK3CA、PIK3CG和CYP19A1等靶点结合而引起毒性作用。本研究为阐明TGT的生殖毒性机制提供了参考，对TGT的质量和安全性评价也具有重要意义。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37062137/
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