【写在前面】
毒理1区：基于毒理证据链（TEC）的鬼臼毒素诱导大鼠肾毒性评估：介导PI3K/Akt/mTOR-Nrf2/HO1通路
【题目及作者信息】
【摘要】
中药不良反应阻碍了中药产业的健康发展和国际化进程。系统有效地评价中药的安全性是当前亟待解决的关键问题。鬼臼毒素（PPT）是从鬼臼属植物中提取的一种高活性化合物。然而，其对肝脏和肾脏等多个靶器官的高毒性和毒性影响了临床应用。基于PPT的药物活性和毒性的同时影响，对其安全性进行系统审查将是一个很好的例子。因此，本研究围绕毒理学证据链（TEC）概念展开。以PPT为DV的主要毒性成分，观察动物的客观毒性损害表型。评估亚组的血清生化指标和病理组织切片，运用代谢组学、脂质组学和网络毒理学从多个角度系统评价PPT的肾毒性。结果表明，PPT诱导的肾毒性表现为肾小管损伤，主要影响甘油磷脂代谢和鞘脂代谢等代谢途径。PPT通过PI3K/Akt/mTOR和Nrf2/HO1途径抑制肾细胞的自噬过程，并诱导体内氧化应激的激活，从而引起肾毒性损伤。本研究充分验证了TEC概念在中药安全性和毒性评价中的可行性。为系统评价中药的安全性提供研究模板。
【前言】
中药以其多组分、多靶点、疗效好、副作用少等特点在国内外得到广泛应用。然而，由于中医药体系的复杂性、中西医结合的日益流行以及人类疾病谱的明显变化，中药不良反应频繁发生（赵芳等，2022），严重影响了人们的日常用药和中医药国际化的发展。目前，毒性分级仍以古代中药典籍中记载的不良反应、毒性参数和临床表现为依据，缺乏可量化的现代研究数据和系统的分级指标。此外，组织病理学目前被用作评估肾毒性的金标准（Fielden和Kolaja，2008），这很容易受到采样、工作量和诊断结果的限制，并且缺乏准确性。病理和生化指标的变化在提示早期肾脏病变方面相对滞后，缺乏及时性。因此，关注中药的安全性，揭示中药毒性和不良反应的产生原因和机制，建立系统、全过程、多模块的综合毒性评价新方法就显得尤为重要。
2019年，课题组提出了毒理学证据链（TEC）策略并不断完善，对DV诱导大鼠肝毒性的毒性物质基础和机制进行了研究（Liu et al.，2020）。结果表明，该评价方法能够系统地表征毒性中药引起的不良反应和毒性过程，可完全应用于基于多组学数据的各类中药毒性研究和风险评估。TEC是一个多环节的中药毒理学评价体系，包括四个维度：有害成分证据（HIE）、损伤表型证据（IPE）、不良反应证据（AOE）和毒性事件证据（TEE）。并从整体性、可重构性和标准性三个方面对TEC的适用性进行评价，定义了毒理学证据评估等级（GTEA）的概念。根据毒性证据各维度的评价目的，对毒性的四个维度进行分级，实现对毒性证据的定量评价。GTEA分为四个等级：S、A、B和C，每个等级有两个附加等级“+”和“-”。例如，本研究中使用的代谢组学、脂质组学和网络毒理学都包含在TEE证据矩阵中。它们都可以描述身体在受到药物毒性影响后分子水平的变化程度。它们比信号通路或代谢通路的结果更系统、更全面。因此，在定量评估中，它们被评为B+，在定性描述中，它们则被评为C+（具体见补充材料）。
鬼臼毒素（PPT）是一种从鬼臼植物如八角莲（DV）的根茎中提取的木脂素的高活性化合物（Canel等人，2000）。它具有杀虫、抗菌、抗炎（Lee等人，2004）、广谱和高效抗肿瘤活性（Oh等人，2021）。然而，PPT毒性大，副作用多，如胃肠道毒性、肝毒性和神经毒性，因此临床实用性有限（Shah et al.，2021；Yu等人，2017）。基于TEC的概念，结合代谢组学和转录组学技术，课题组确认了PPT诱导肾毒性的毒性物质基础，并进行了初步探索（Kong et al.，2022）。结果表明，PPT引起的肾脏损伤主要发生在甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢和能量代谢中。LPC、棕榈酸和硫酸盐等物质可能是潜在的生物标志物。本研究将基于TEC的概念，结合代谢组学、脂质组学和网络药理学等技术，继续评估PPT诱导的肾毒性，并深入探讨其诱导机制。代谢组学可以通过使用LC-MS定性或定量分析生物流体和组织中内源性代谢产物的动态变化，具有高灵敏度和良好的准确性。脂质组学是代谢组学的一个分支，小分子脂质在调节正常肾功能和肾脏疾病的发病机制中发挥着重要作用（赵等，2015）。脂质组学可以全面分析有毒中药作用于人体后，血液和毒性靶器官中脂质代谢产物的变化以及脂质代谢途径的异常。代谢组学和脂质组学的结合为确定疾病病理学的关键驱动因素提供了一个完整的代谢图谱，并有助于研究脂质和其他代谢产物在疾病进展中的相互作用。
本研究将TEC概念纳入PPT诱导肾毒性的综合评估中。以早期从DV中提取的毒性成分PPT为基础，评价其对大鼠的客观毒性损伤表型和肾毒性损伤。随后，通过灵活运用组学、网络毒理学、蛋白质印迹等多种技术手段，从多个角度对肾毒性机制进行了层层阐释和验证。
【结果部分】
1. 客观毒性表现（动物行为学损伤表型证据：IPE）
图1 损伤表型证据概览（IPE）（A：NS组；B：PPT组；1-3：大鼠的外观、姿势和行为；C：体重变化图；D：毒性损伤程度；红圈：皮肤表面红斑、弓背、流鼻涕和肛门附近水样便）。
2. PPT肾毒性的毒理学研究（AOE）
图2 PPT引起的肾毒性表现可视化。（A-C：给药后的生化参数；A:UA；B:BUN；C:Scr；*：与NS比较（***P<0.001）；D：NS组病理表现；E：PPT组病理表现；1：原始磁化1000µm；2：原始磁化200µm；黑色箭头：肾小管轻度扩张，管腔不规则）。
3. PPT肾毒性的代谢组学研究（TEE）
图3 PPT诱发肾毒性的代谢组学研究（TEE）。（A：方法学研究结果；B：PCA模型；1:ESI+；2:ESI-；CN：对照组；PPT：鬼臼毒素组）。
4. PPT肾毒性的脂质组学研究（TEE）
图4 PPT诱发肾毒性的脂质组学特征（TEE）（A-B：血清样品和肾脏样品的脂质组学方法学研究结果，A：血清脂质组学；B：肾脏脂质组学，C-D:血清和肾脏样品中脂质组学的PCA模型，C：血清脂组学；D：肾脏脂组学，1:ESI+；2:ESI-；CN：对照组；PPT：鬼臼毒素组）。
5. PPT肾毒性的网络毒理学研究（TEE）
图5 网络毒理学结果（A：韦恩图可视化结果；B：PPI 可视化结果；C：KEGG 分析结果）
6. PPT诱导肾毒性的机制
图6 代谢和生化反应模式。（Con：对照组；M: PPT组；*:P<0.05）
【讨论与结论】
本研究基于TEC的概念，系统研究了PPT诱导大鼠肾毒性的潜在毒性物质基础和毒性机制。首先，根据课题组前期研究，PPT已被确定为DV的毒性成分，并已应用于动物肾毒性研究（HIE）；其次，通过观察动物客观毒性损伤表型（IPE），评估血清生化指标和组织病理学及其他实质性毒性损伤（AOE），获得PPT的毒理学证据。结果表明，PPT所致大鼠肾毒性的主要损伤是肾小管损伤；之后，通过代谢组学和脂质组学技术阐明了肾毒性引起的内源性小分子代谢产物和脂质成分（TEE）的变化，并鉴定了潜在的生物标志物，如多胺、吲哚硫酸酯和LPC、LPE等特异性脂质，进一步的KEGG富集分析发现，它主要与甘油磷脂代谢和鞘脂代谢等相关代谢途径有关；最后，基于网络毒理学，建立了“有毒成分-靶标-作用-途径”的虚拟网络模型，筛选了关键靶标，并对途径进行了丰富和验证。结果表明，PPT通过PI3K/Akt/mTOR-Nrf2/HO1信号通路参与肾脏自噬和氧化应激，诱导肾毒性损伤。本研究充分验证了TEC概念用于中药安全性和毒性评价的可行性。它可以成为未来研究其他中药毒性机制的有力工具。
【原文获取链接】
https://authors.elsevier.com/sd/article/S0147-6513(23)00896-5
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