2023年7月17日，Nature Methods 在线发表了中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）陈跃军研究组题为“Comprehensive spatiotemporal mapping of single-cell lineages in developing mouse brain by CRISPR-based barcoding”的研究论文，该研究通过建立能够应用于小鼠体内任意组织器官的谱系示踪新技术——CREST，解析了小鼠中脑在胚胎发育过程中的单细胞时空谱系图谱，揭示了小鼠中脑发育过程中新的谱系分化路径和分子调控机制。CREST技术为高通量解析小鼠组织器官发育的单细胞谱系提供了全新的工具，为从谱系视角研究各种发育疾病的发病机制提供了新的研究工具。
帕金森病是中脑黑质多巴胺能神经元特异性丢失导致的以运动功能障碍为主要表型的神经退行性疾病，移植干细胞分化得到的多巴胺能神经前体细胞是治疗帕金森病最具潜力的治疗措施。陈跃军研究组一直专注于人多能干细胞的神经分化和帕金森病的细胞治疗，在前期研究中建立了高效的人多巴胺能神经细胞的分化方法（2016，Cell Stem Cell；2021，Cell Stem Cell），并进一步建立基于病毒条形码标记的高通量克隆谱系示踪新技术-SISBAR，解析了人多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经细胞的单细胞谱系（2023，Cell Stem Cell，Cover Story）。通过SISBAR技术，团队成员意外发现在克隆水平，人中脑多巴胺能神经前体细胞可以分化为中脑多巴胺能神经元和中脑底板谷氨酸能神经元，这一体外分化细胞谱系是否和内源细胞的发育谱系一致？还是体外分化产生的假象？针对这一问题，研究团队进一步以小鼠为模型研究了体内中脑多巴胺能神经细胞的发育分化谱系。
然而传统基于重组酶技术的谱系示踪通量有限，一般只能示踪1-2个谱系，并且没有单克隆解析度。最近病毒条形码标记技术也被应用于神经系统发育谱系的研究（Christian Mayer et al，2022 Nature；Jonas Frisén et al，2022 Nature Neuroscience），通过在侧脑室注射条形码标记的病毒，对脑室区（ventricular zone，VZ）的神经干细胞进行标记，并结合单细胞测序对这些细胞的子代细胞进行高通量谱系示踪。然而，这种方法只能标记VZ区的神经干细胞，无法实现对全脑任意位置神经干细胞的标记，并且侧脑室病毒注射的方法适用于神经管闭合以后发育的脑区（通常E11天以后），而对于早期发育脑区，比如E8-8.5开始发育的中脑组织，则无法通过该方法进行标记。因此，急需开发一种能够对脑内任意细胞群体进行高通量条形码标记和谱系示踪的新方法。
团队成员利用CRISPR介导的条形码标记技术，并进一步结合重组酶系统和单细胞测序技术，开发了一种在体高通量谱系示踪的方法——CREST，并构建了相应的谱系示踪工具小鼠品系（图A）。利用CREST技术，研究团队绘制了全面的中脑发育谱系图谱，从而深入探究中脑神经系统的发育过程和体内中脑多巴胺能神经细胞的发育谱系。
研究团队首先利用基于CREST的“快照”策略（snapCREST），解析了特定发育时间点中脑不同细胞类型之间的谱系关系（图B），发现了许多先前未被报导的亚区特异性的谱系关系：在翼板中，谷氨酸能神经元与GABA能神经元具有共同的谱系起源；而在基板中，这两类神经元具有相对独立的起源；在底板中，谷氨酸能神经元则与多巴胺能神经元具有共同的起源（图C）。研究团队进一步在克隆水平对祖细胞的分化命运进行了无偏好的分类，发现单个中脑祖细胞的分化命运可以被分为六种主要类型。基于这一结果，研究团队提出了“祖细胞原型”的概念，这六种中脑祖细胞原型囊括了中脑发育过程中单个中脑祖细胞的不同分化命运（图D）。研究团队进一步在克隆水平对中脑底板神经祖细胞的分化命运进行了分析，发现单个中脑底板神经祖细胞存在三种不同的分化命运：中脑底板神经祖细胞经由中脑底板神经母细胞，有的偏好分化成多巴胺能神经元，有的偏好分化成谷氨酸能神经元、有的则能同时分化成多巴胺能和谷氨酸能神经元。通过对不同分化命运的底板神经母细胞差异表达基因的分析，研究人员发现，Pbx1转录因子在偏好产生多巴胺能神经元的底板神经母细胞内显著高表达（图E）。当Pbx1被敲除后，共释放谷氨酸的中脑多巴胺能神经元的比例显著增加，这证明Pbx1在决定中脑底板来源神经元的谷氨酸能表型和多巴胺能表型中的关键作用（图F）。这些结果展示了CREST技术在克隆水平解析细胞命运决定分子机制中的强大能力。
snapCREST可以解析特定发育时间点不同细胞类型之间的谱系关系，但是由于祖细胞在被用于单细胞测序后无法继续分化，这一策略无法解析不同祖细胞类型在下一阶段的分化命运。为此，研究人员进一步开发了基于CREST的“连拍”策略（pandaCREST）。该策略结合了克隆分离策略、类器官培养技术与CREST技术，实现了发育过程中单个祖细胞转录组信息及其分化潜能的同时获得（图G）。通过pandaCREST，研究人员解析了中脑不同转录组定义的祖细胞群的分化命运。进一步的单克隆分析发现，在同一转录组定义的祖细胞群内，单个祖细胞具有不同的分化命运，并且在转录组水平上，不同分化命运的祖细胞仍存在微小的差异，提示同一祖细胞类群内单个细胞的不同分化命运是预先确定的（图H）。
CREST技术是一种高通量谱系示踪的新方法，它不仅可以在单细胞水平解析体内的发育谱系，而且可以在克隆水平解析发育过程中命运决定的分子机制，是目前已知的唯一可以对脑内任意细胞群体进行高通量谱系示踪的方法，为解析全脑发育谱系图谱提供了关键技术。通过将CREST 小鼠与任意组织器官或特定类型细胞的Cre/CreER小鼠交配，CREST技术可以被广泛地应用于其他组织器官的发育谱系研究，并可以用于疾病、损伤或再生条件下的谱系研究。这为在单细胞和单克隆水平研究不同组织器官的发育和疾病发生提供了通用技术方法。
同时这一研究也证明，我们在体外分化得到的中脑多巴胺能神经元不仅在基因表达，电生理特征，和环路整合特异性等方面和内源多巴胺能神经元相似（2021，Cell Stem Cell），其分化谱系也和内源多巴胺能神经元一致（2023，Cell Stem Cell；2023 Nature Methods （本研究）），为帕金森病细胞治疗中中脑多巴胺能神经细胞体外分化的准确性提供了理论依据。
该研究由中科院脑智卓越中心博士研究生谢连顺与中科院营养健康所博士研究生刘恒心，在脑智卓越中心陈跃军研究员和临港实验室魏武研究员的指导下完成。中科院脑智卓越中心游致文博士、王露悦博士、李依纹博士、博士研究生章馨月、何慧博士、职工袁停立、郑文平博士，复旦大学儿科医院研究生计筱珊，上海跃赛生物科技有限公司吴子彦博士，复旦大学脑科学研究院熊曼研究员，复旦大学周文浩教授，中科院脑智卓越中心蒲慕明院士为本研究提供了重要帮助。本研究得到了中科院、科技部、基金委和上海市科委的资助。
图注：（A）CREST小鼠示意图。（B）“快照式”谱系示踪实验流程。（C）E15.5天胚胎腹侧中脑的细胞类群间的谱系关系。（D）腹侧中脑的六种祖细胞原型的分化命运示意图。（E）偏好产生多巴胺或谷氨酸能神经元的神经母细胞中的差异表达基因。（F）Pbx1敲除造成Vglut2阳性的多巴胺能神经元比例显著增加。（G）“连拍式”谱系示踪实验流程。（H）单个中脑基板内侧神经祖细胞的分化命运统计。
陈跃军，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，高级研究员。主要从事人多能干细胞的神经分化和神经退行性疾病的细胞治疗，开发了能够在体外和体内进行高通量谱系示踪的新技术SISBAR和CREST，解析了多巴胺能神经分化的单细胞谱系，在此基础上开发了更安全有效的帕金森病细胞治疗新策略；解析了帕金森病细胞治疗中移植细胞环路整合和作用的新机制。研究成果以通讯作者（含共同）发表在Cell Stem Cell（4篇）, Nature Methods, Journal of Clinical Investigation, Brain等杂志。陈跃军研究组长期招收干细胞生物学，神经环路或发育神经生物学背景的优秀博士后，年薪30-45万（根据发表的研究论文）。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41592-023-01947-3
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