研究背景
可持续的化学合成方法极大地推动了人工酶的发展。人工酶的开发面临的最大挑战是如何设计催化活性位点。主要是通过将非生物的催化活性位点基团（过渡金属复合物或有机催化官能团）引入蛋白质结构中开发人工酶，然后调控蛋白质的环境提高催化活性。然而目前对人工酶的研究主要集中于引入单个非天然催化基团，因而反应速率、选择性以及反应类型较受限制。天然酶的优异活性和选择性来源于其多个活性位点间的协同作用，因此模拟天然酶将多个催化中心引入蛋白质结构中显得尤为重要。
提出问题
在双分子反应中两个底物同时分别被两个催化位点活化的过程称为协同催化，其通过降低反应的HOMO-LUMO能隙加速反应的进行。但是协同催化受到将两个活性底物以生产方向结合在一起的熵成本的限制。相比之下，活性基团的特定空间位置和取向是酶的一个特征。因此作者设想在一个稳定的蛋白质支架中，将两个非生物基团置于适当的位置，将产生高效和选择性的人工酶。
研究成果
近日，荷兰格罗宁根大学Gerard Roelfes教授通过在蛋白质骨架中引入两个非天然催化位点，实现了首例在人工酶中进行的协同催化反应。此策略基于该课题组已报道的两种人工酶设计方法：通过基因编码引入具有催化活性的非天然氨基酸（Nat. Chem., 2018, 10, 946）和通过超分子组装引入金属络合物（J. Am. Chem. Soc., 2015, 137, 9796）。
Nat. Chem., 2018, 10, 946（图A）
J. Am. Chem. Soc., 2015, 137, 9796（图B）
通过将对氨基苯丙氨酸嵌入到乳球菌多药转录调节子的疏水孔中，可以提高苯胺侧链对腙和肟形成反应的催化活性。
一种超分子人工金属酶的新设计，利用转录因子乳球菌多药耐药调节器（LmrR）的中心疏水空腔的混杂性作为平面配位复合物的通用结合位点，不提供特定的蛋白质结合相互作用。
得益于蛋白质内部空腔提供的手性环境和两个非天然催化基团的物理空间排布，研究者使用这种人工酶实现了一例高反应活性和高立体选择性的迈克尔加成反应。
英雄所见略同
两个月内“构建双活性位点的人工酶”再次登上《Nature catalysis》
Published on line:
16 December 2019
Published on line:
10 February 2020(本文)
研究内容
设计具有两个酶活性位点或一个酶和一个化学催化位点的催化活性蛋白质的方法。该方法重复性优异，可扩大人工催化剂的多样性、显著提高天然酶的催化性能。
设计合成了具有两个非生物催化活性位点的人工酶，由一个基因编码的非自然的催化pAF残基与一个催化活性的Cu(II)复合物的协同组合而成，该人工酶在Michael加成反应中具有优异的催化活性和对映选择性（>99% e.e.）。
相同点
1、均基于构建双活性位点的人工酶。2、构建策略类似。3、均能达到较优的催化性能，可媲美天然酶的催化性能等。
不同点
1、人工酶选用的蛋白酶和化学配体不同。2、人工酶催化的反应类型不同。3、本文制备的人工酶的底物适用范围更广泛，利用价值更广泛等。
【点评】奇妙的思维，顶级的研究，英雄所见略同。这两项研究工作的方法论可促使后来的研究人员通过基因工程、酶工程构建生物催化和化学催化双活性位点，可筛选出更广泛的、更实用的反应，反之，也可通过反应来逆向设计催化性能更佳的人工酶。同时，两项工作均通过构建双活性位点的策略制备媲美天然酶的人工酶，极大的推动了酶工程、基因工程和有机合成的进步，为实现人工酶的工业化迈出了坚实的一步。
研究过程
要点1 基于LmrR蛋白设计的人工酶
该人工酶的设计基于一种乳酸乳球菌多药耐药性调节因子（LmrR）。此蛋白是一个小型的同形二聚体，在二聚体界面上有一个异常大的疏水性空腔，空腔中心有两个相互平行色氨酸残基可以通过π堆积作用去结合外来平面分子（图1a）。之前Roelfes教授课题组已经运用LmrR蛋白的这种特性去结合非天然金属辅助因子例如菲咯啉铜Cu(1,10-phenanthroline)(NO3)2来构建人工金属酶并实现了吲哚对烯酮的不对称加成反应。其中，菲咯啉铜辅助因子作为路易斯酸来活化烯酮（图1b）。
同时，使用作者以报道的扩展遗传密码方法引入催化基团，该设计酶具有非天然催化的对氨基苯丙氨酸(pAF)残基。在这里，pAF的苯胺侧链被用作从醛类生成腙的亲核催化剂(图1c)。结合以上想法，研究者设想能否将这两种人工酶设计策略结合在一个蛋白质分子中，以创建具有两个可以同时作用的非天然催化位点的人工酶。在他们的设计中，α,β-不饱和醛可以通过与苯胺侧链形成亚胺离子中间体而被活化，而烯醇盐则通过路易斯酸Cu(ll)-phen络合物活化酮而形成，从而通过协同催化得到迈克尔加成产物（图1d）。亲核试剂结合的铜络合物将结合在两个平行的色氨酸残基之间，可以将烯醇盐递送至活化的烯酮的一个优选的前手性面，从而可以实现高的立体选择性。
要点2 新型人工酶LmrR_V15pAF/Cu(ll)-phen协同催化的Michael加成反应
作者选用的LmrR蛋白变体为LmrR_V15pAF，pAF残基通过专用的正交翻译系统直接引入。然后，通过向LmrR_V15pAF蛋白缓冲液中加入Cu(ll)-phen，经超分子自组装结合得到路易斯酸位点。为了检测这种新型人工酶的催化性能，研究者选用了一种反应活性非常低的咪唑酮（1a）作为迈克尔供体，但其可以在金属路易斯酸的作用下烯醇化。然后加成到丙烯醛（2a）上得到迈克尔加成产物（3a）。
对照实验显示，仅有一个催化位点是不能实现该反应的（Table 1,entry 1-2）。当LmrR_V15pAF与Cu(ll)-phen的协同组合时，该反应能够得到36%的收率和 86%的e.e.值（Table 1,entry 5）。LmrR_V15pAF与Cu(NO3)2的结合仅10%的e.e.值，这也说明铜配合物与两个中心色氨酸残基的结合对于反应的对映选择性十分重要（Table 1,entry 4）。
要点3 人工酶的反应条件优化及诱变研究
随后作者用巴豆醛（2b）代替丙烯醛作为迈克尔受体进行了该反应，得到含两个手性中心的产物（3b），该反应具有优良的对映选择性。通过将中心色氨酸残基突变为丙氨酸（即含有Cu（II）-phen的LmrR_V15pAF_W96A）来去除Cu（II）-phen结合位点，导致了较低的产率和e.e.，证实精确定位Cu(ii)结合烯醛相对于激活烯醛的重要性（Table 2, entry 9）。
由于直接与蛋白空腔中心色氨酸相邻的8位蛋氨酸诱变在某些情况下有利于催化反应，在催化作用下制备并评估了在M8位置含有多种疏水性和带电侧链的LmrR突变体（Table 2, entries 10–13）。筛选得到的到突变体LmrR_V15pAF_M8L能够同时提升反应收率和立体选择性而得到>99/93% e.e.、6:1 d.r.和 82%的收率（Table 2, entry 14），即使催化剂用量降至0.5 mol%也不会影响反应的立体选择性（Table 2, entries 6–8, 16 and 17)。
要点4 底物适用性范围研究
最后，作者考察了该反应的底物适用性范围。实验结果表明此人工酶能够兼容一系列的不饱和醛和咪唑酮底物。除了芳香环取代(2d)的不饱和醛会导致反应对映选择性的降低外（Table 2, entries 3-4），其他烷基取代的不饱和醛和各种取代的咪唑酮底物均能得到非常优异的立体选择性。相比于LmrR_V15pAF，突变体LmrR_V15pAF_M8L能够给出相似或者更好的收率和对映选择性(3b, 3c, 3e, 3f, 3g 和 3h)。另外研究者也通过捕捉关键反应中间体亚胺盐的形成从而证实了之前推测的协同反应机理。
全文小结
作者设计合成了具有两个非生物催化活性位点的人工酶，由一个基因编码的非自然的催化pAF残基与一个催化活性的Cu(II)复合物的协同组合而成，其中，Cu(II)复合物是由LmrR的二聚体界面的疏水空腔中的超分子结合引入。该人工酶在Michael加成反应中具有优异的催化活性和对映选择性（>99% e.e.）。人工酶设计高度灵活，可结合其他有机催化非天然氨基酸和其他金属络合物。本研究为实现新的天然酶催化反应提供了一条有吸引力的途径。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41929-019-0420-6
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