论文ID
题目：Structures of the holo CRISPR RNA-guided transposon integration complex
期刊：Nature
IF：69.504
发表时间：2022年11月28日
通讯作者单位：康奈尔大学
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05573-5
主要内容：
CRISPR-Cas是一种细菌防御系统，可以攻击入侵的DNA以保护宿主细胞，或者帮助将DNA安全地插入基因组。这后一种类型的CRISPR-Cas系统的结构现在已经被可视化了。
敌对势力之间的合作改变了历史的进程，确保了盟军在第二次世界大战中的胜利。现在有两项研究，一项发表在《自然》杂志上，一项发表在《细胞》杂志上在不同的环境中揭示了敌人合作的本质：名为CRISPR-Cas的细菌防御系统与来自入侵者的DNA之间的战斗。作者将CRISPR-Cas复合物的结构可视化，该复合物将入侵的DNA引导到细菌基因组中适合入侵者和宿主的位置。将DNA序列添加到特定的基因组位点的能力对于根据科学家的要求修改细胞和生物体很有价值。因此，新的蓝图对研究来说是个好消息。
CRISPR-Cas系统消除入侵的 "寄生 "DNA，包括病毒DNA或转座子（自我复制并在基因组中移动的DNA序列）。这些系统存储入侵DNA的短片段，并使用存储序列的RNA副本作为指导，帮助Cas蛋白识别并切断入侵的DNA，从而防止它损害细胞。
尽管CRISPR-Cas已被广泛地重新利用作为向基因组引入修饰的工具，但它通常不适合于基因插入。事实上，转座子本身是更有效的基因添加工具，因为它们编码一种转座酶，催化转座子DNA移动到新的基因组部位。然而，大多数转座酶在基因组的任意位置插入其有效载荷，这可能会伤害宿主细胞。
2017年，人们发现了一类CRISPR相关转座子（CAST），它以一种不寻常的方式与CRISPR一起作用7。特殊的Cas-RNA复合物并不清除入侵的DNA，而是与CAST合作，引导该CAST的转座。引导RNA序列可以预测CAST将被插入的DNA序列（在5-10个碱基对内），并且可以通过改变该序列进行重新编程。这种专门的CRISPR-Cas作用将CAST引导到基因组中的 "安全 "位置，从而避免杀死宿主，同时使CAST得以传播。宿主细胞还可以从转座子上携带的其他货物中获益，如抗生素抗性基因。这些系统用于可编程DNA插入的潜力立即在细菌中得到利用，但迄今为止，还没有证据表明CAST在有核真核细胞（例如人类细胞）中具有活性。
研究已经确定和描述了几个CAST的组成部分，并描述了CAST机制的部分结构。这些结构包括：Cas与引导RNA和目标DNA的复合物（转座子整合到其中）；TniQ，"适配器 "蛋白，它与Cas-RNA-DNA复合物结合并招募转座机械的其他元素；TnsC蛋白，它沿着目标DNA聚合成螺旋状的丝状物并招募转座酶；以及TnsB（转座酶）。
然而，人们对所有这些成分如何合作知之甚少。在目前的研究中，Park等人1和Schmitz等人使用低温电子显微镜描述了完整的CRISPR-Cas靶向CAST复合体的原子结构，揭示了所有的部件是如何组合在一起的（图1）。
这两个小组都仔细研究了从蓝绿色水生细菌Scytonema hofmannii中分离出来的一个小型CAST，称为ShCAST。Schmitz及其同事重建了一个复合物，包括复合物的 "靶向模块"（Cas蛋白Cas12k和一个锚定在其目标DNA上的引导RNA），以及TniQ和TnsC。该结构显示，正如预期的那样，TniQ在引导RNA和TnsC迷你丝的起点之间形成一个桥梁。意外的是，该复合物还包含一个宿主蛋白，S15。这种蛋白质已知是细菌核糖体（产生蛋白质的分子机器）的一部分。作者用仔细的生物化学方法表明，它是帮助TniQ与Cas-RNA复合物结合并招募TnsC的组成部分。
Park和他的同事们将RNA引导的转座的最终产品可视化，它涉及一个 "插入模块"，包括与转座子DNA两端结合的TnsB的四个亚单位，此外还有其他复杂的成分。他们的结构显示了ShCAST的所有成分是如何结合CRISPR-Cas系统的RNA引导的靶向性和转座酶的插入能力。
两份报告都表明，整体大于部分的总和。在以前的Cas12k-RNA-DNA结构中，DNA只是与RNA部分配对--但新的工作表明，当TniQ、TnsC和S15存在时，配对是完整的。最新的结构还显示，在完整的组合中，与TnsC接触最紧密的DNA双链与以前孤立的TnsC-DNA复合体的结构不同。
TnsC和TnsB之间的相互作用是转座子定向的一个关键方面。TnsC的丝状物被TnsB修剪成一定大小，使转座酶与导向RNA所指定的目标DNA序列紧密相连。反过来，TnsB的催化活性（与许多单独完成其工作的转座酶不同）取决于与TnsC的相互作用。
从Park及其同事的结构中，一个令人惊讶的观察是，迷你丝中TnsC分子的数量是可变的。这种灵活性表明，一个能够如此精确地瞄准特定DNA序列的系统在选择的插入点上也能显示出5-10个碱基对的变化。这样的特点可能反映了对自然战场的适应性，使CAST插入的小变化能够将其加入宿主的危害降到最低。现在需要努力描述TnsC组装和拆卸的动态，并阐明TnsB在其中的确切作用。
转座酶的活性是如何控制的？人们可能预计TnsC会改变TnsB的构象以激活其催化核心。因此，有趣的是，Park等人在全复合物中观察到的TnsB结构与没有TnsC的TnsB结构相似。此外，作者发现TnsC和TnsB的催化核心之间没有任何接触，可以激活TnsB。
关于TnsC如何激活TnsB的线索，可以通过考虑一种叫做MuA的相关转座酶来发现。对于TnsB和MuA来说，目标DNA必须强烈弯曲以适应转座酶的活性口袋。在DNA上做这样一个强烈的弯曲在能量上是困难的，而稳定弯曲的目标DNA的因素会增强MuA的转座。也许TnsC激活转座，至少部分是通过将弯曲的目标DNA带到TnsB。事实上，在没有TnsC的情况下，TnsB可能无法与天然的目标DNA结合，因为TnsC将其与DNA捆绑在一起。此外，在Park等人报告的结构中，TnsC的迷你丝被定位为与TnsB两侧的目标DNA接触，也许是为了稳定其弯曲的形式。最后，作者观察到TnsB和TnsC之间的相互作用导致TnsB的一个无序段以一种可能有助于稳定弯曲的目标DNA的方式折叠和对接。
这两篇论文共同强调了CRISPR和转座子--它们通常是相互对立的--如何能够联合起来，战略性地选择插入大型DNA有效载荷的目标位置。所提供的分子观点将帮助基因组工程师开发具有更多目标位置的基于CAST的基因插入系统，并可能帮助研究人员设计出表现出较少脱靶活动的系统变体。
细菌S15蛋白是ShCAST的内在组成部分，这一意外发现可能被证明是在真核生物基因组中实现大型定向插入的一个突破口。Schmitz及其同事表明，S15的人类亲属并不促进ShCAST的活性，这可以解释为什么以前试图将该系统用于真核细胞的尝试失败。细菌S15促进真核细胞中ShCAST活性的能力肯定会很快得到测试。
最后，CAST系统有可能被用作建立更简单转座子的可编程目标的蓝图。这可以帮助CRISPR介导的基因插入不同的细胞和生物体中--这是一个令人兴奋的未来研究前景。
参考文献
1 Park, J.-U. et al. Nature 613, 775–782 (2023).
2 Schmitz, M., Querques, I., Oberli, S., Chanez, C. & Jinek, M. Cell 185, 4999–5010 (2022).
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-022-05573-5
转自：“生物医学科研之家”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
