原文题目：A randomized trial of oral gamma aminobutyric acid (GABA) or the combination of GABA with glutamic acid decarboxylase (GAD) on pancreatic islet endocrine function in children with newly diagnosed type 1 diabetes
通讯作者：Kenneth L. McCormick
隶属单位：阿拉巴马大学伯明翰分校小儿内分泌科儿科
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35544-3
1型糖尿病（T1D）的发病机制需要胰腺β细胞的自身免疫性破坏。一旦出现高血糖，超过70%的胰岛β细胞已被根除。存活的β细胞、胰腺祖细胞的增殖，加上α细胞、腺泡细胞、导管细胞或肝细胞的转分化，都有可能恢复胰岛素的产生。
据报道，T1D 患者存在多种免疫学异常，包括产生针对胰岛素分子的自身抗体、谷氨酸脱羧酶 （GAD65） 的 65 kD 亚型、各种胰岛抗原和锌转运蛋白 8 （ZnT8），以及抑制 T 细胞介导的朗格汉斯胰岛破坏的调节性 T 细胞 （Treg） 能力降低。迄今为止，许多试图抵御或逆转T1D的研究都集中在免疫抑制或调节上。这可能会产生长期副作用。然而，最近的抗CD3抗体试验显示，T1D的临床诊断延迟了3年。
动物和体外研究认为，γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸脱羧酶（GAD）在胰腺中起着基本的代谢作用，可能是T1D的潜在治疗靶点。至于GAD65抗原（GAD-明矾）治疗本身在新发T1D中，2008年对70名患者的初步报告是吉祥的，因为30个月内残留的β细胞功能在一定程度上得以保留。然而，后来一项针对334名患者的更全面的研究未能复制这一发现。然而，这两项研究和另一项研究的个体水平分析发现研究参与者对HLA DR3-DQ2呈阳性，但对HLA-DR4-DQ8呈阴性，显示出GAD-明矾单药治疗后β细胞保存增强。
GABA，一种主要的抑制性神经递质，在胰岛中含量丰富并参与β细胞和α细胞的旁分泌调节。GAD是使谷氨酸脱羧形成GABA的酶，是T1D的主要自身抗原。体外实验发现，用GABA受体阻断剂治疗的分离人胰岛在生理葡萄糖浓度下胰岛素分泌减少。此外，GABA缺乏的胰岛没有显示出适当的胰高血糖素抑制，以响应体外葡萄糖浓度的增加，提示GABA直接参与抑制胰腺α细胞中胰高血糖素分泌。GABA 激活 Ca2+ - P13K/Akt 生长和存活途径，并避免用链脲佐菌素 （STZ） 处理体内胰岛细胞系中的应激诱导的细胞凋亡。在体内，如果在生命早期给予，GABA会延迟非肥胖糖尿病患者（NOD）和STZ治疗小鼠的糖尿病发作。而且，如果在糖尿病已经开始后在NOD和STZ小鼠中开始GABA治疗，则血糖正常随之而来。这些机制尚不完全清楚，但建议涉及胰腺自身免疫环境的缓和全身炎症。
图2：研究组的空腹和AUC c肽随时间的变化。
除了在两种不同的糖尿病小鼠模型中证明GABA的β细胞再生和胰高血糖素抑制外，Soltani及其同事还描述了炎性细胞因子表达的显着降低。功能性GABA受体存在于T细胞上并增加脾T调节细胞的表达，从而可能阻止或减缓T细胞介导的β细胞破坏。在体内，GABA抑制将糖尿病脾T细胞移植到NOD / SCID小鼠模型中后T1D的过继转移。单独地，GABA和GAD-明矾促进NOD小鼠中移植β细胞的存活，而联合治疗促进协同和剂量依赖性β细胞存活。迄今为止，无论是单独使用GABA还是GABA-GAD联合使用，都没有被探索为T1D研究参与者的治疗剂。在这里，研究人员表明，在这项低剂量GABA的人体试验中，单独或作为联合治疗GABA/GAD，虽然主要结局β细胞功能尚未得到统计学证明，但GABA/GAD组合减少了空腹和膳食刺激的血清胰高血糖素。血糖控制、胰岛素原和糖尿病自身抗体，所有次要结局，在GABA/GAD和安慰剂之间相似。此外，还确定了治疗的安全性和耐受性。
这项GABA和GABA/GAD联合治疗新发T1D儿童的前瞻性随机对照试验证实了口服GABA的安全性和耐受性，但没有达到其主要目标，即保留β细胞功能（图2）。然而，次要结局显示，口服GABA/GAD治疗12个月后，空腹以及营养刺激的胰高血糖素分泌显著减少（图4）。这一观察结果与GABA（或GABA/GAD）对α细胞具有旁分泌抑制的动物/细胞研究有利。
图3：研究组随时间推移的血糖控制。
据报道，从β细胞分泌的GABA对胰岛素分泌具有自分泌作用，以及对α细胞胰高血糖素产生的旁分泌抑制。虽然独特的GABA自分泌作用仍未确定，但胰高血糖素分泌的生理相关旁分泌抑制或α细胞质量减少已在分离的细胞或胰岛，灌注或活检胰腺或体内动物研究中反复记录。在与其同源氯离子通道结合后，GABA产生α细胞膜超极化，从而阻碍电压依赖性钙通道，从而减少胰高血糖素的输出。例如，在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠中，每天腹膜内12天GABA（10mg / kg）淬灭了α细胞质量的7倍强劲增加，这发生在对照中。而且，与β细胞相关，GABA增加了表达GLP-1的α细胞的增殖。反过来，后者可以合理地增强β细胞功能和生长。
在另一种1型糖尿病模型（多次低剂量STZ，MDSD）中，当GABA添加到饮用水（6mg / ml）中时，可降低血清胰高血糖素和α细胞质量。在糖尿病诱导前用20μmol/ kg腹膜内GABA治疗的MDSD小鼠中也发现了类似的串联α和β细胞GABA效应，并且在一系列先前患有严重高血糖的糖尿病小鼠中。胰岛研究始终如一地证实了GABA对胰高血糖素分泌的抑制作用。在大鼠胰岛中，注意到GABA抑制葡萄糖刺激的胰高血糖素分泌并且在正常小鼠胰岛或灌注的胰腺中，观察到胰高血糖素分泌的抑制。最后，当将非治愈性质量的正常人胰岛移植到糖尿病小鼠（NOD - seid-Υ）中时，在添加GABA（6mg / ml）的饮用水5周后，血清胰高血糖素降低约80%。
胰高血糖素受体的拮抗作用，或通过基因敲除，特别是在面对胰岛素缺乏时，促进正常血糖。以以下观察结果为例：（i。）即使没有补充胰岛素，通过阻断糖尿病肥胖小鼠的胰高血糖素受体，也使高血糖正常化， （二）在高脂肪2型糖尿病小鼠中，胰高血糖素受体的敲除流产了肥胖，高胰岛素血症和异常脂肪生成，并显着预防了高血糖症， （三）在胰高血糖素受体无效小鼠中，在链脲佐菌素β细胞大量破坏后，尽管有明显的高胰高血糖素血症（比野生型高14倍），但血糖正常， （四）单独胰高血糖素受体抗体，即无胰岛素治疗，可使1型糖尿病NOD小鼠的高血糖正常化，最后，在患有 T1D 的人群中，单次皮下注射胰高血糖素受体抗体可在几天内导致胰岛素剂量减少 14%，并通过连续血糖监测评估改善血糖控制。最近，单克隆胰高血糖素受体拮抗剂（Ab-4）纠正了1型糖尿病啮齿动物（NOD和PANIC-ATTAC小鼠模型）以及小鼠植入的人胰岛异种移植物中的血糖并诱导了β细胞的恢复。事实上，在NOD小鼠中，与对照组相比，Ab-4抗体增加了约900%的胰岛素胰岛面积。
与之前的报告一致，研究人员发现血清胰高血糖素在T1D诊断后的第一年逐渐增加（图4），这种现象可持续3-5年。胰高血糖素可能会恶化血糖控制，通过对肝脏、脂肪和神经代谢的外周效应。即使在非糖尿病成人中，空腹胰高血糖素与纵向β细胞功能呈负相关，推断α细胞功能障碍是葡萄糖代谢紊乱的早期阶段。虽然在研究人员的研究中发现GABA/GAD抑制了血清胰高血糖素，但降低的百分比可能不足以影响血糖控制（图3），即该组中胰岛素调节的A1c（IDAA1c）。值得注意的是，使用IDAA1c的参考标准品，膳食刺激的c肽>300 pM，有趋势表明GABA/GAD组在5个月时有所改善。如补充图2所示，血清胰高血糖素与血清葡萄糖呈正相关，这推断胰高血糖素在葡萄糖稳态中的作用。在研究人员的安慰剂队列中，一年时的AUC胰高血糖素比基线升高了24%。这与之前报道的T1D患儿餐后增加37%和51%相比有利。
GABA组中IDAA1c的略有增加（图3b）值得讨论。这个计算的血糖控制指标是最不客观的指标，因为它包含了TDD，在研究人员的研究中，TDD取决于参与者的纸质记录和回忆。此外，TDD还受到运动，碳水化合物负荷，并发疾病和其他因素的影响。如前所述，使用膳食刺激的c肽>300 pmol/l，三组之间的血糖控制没有差异。同样，那些过渡到胰岛素泵的患者，提供更精确的TDD数字评估，在IDAA1c方面没有差异。最后，12个月时各组的空腹和AUC葡萄糖没有差异。
这项研究有很多优点。最重要的是，作为辅助药物，这是第一个在新诊断的人类中进行的GABA研究。此外，通过专门研究儿科人群，研究人员能够招募非常年轻的T1D患者，这些患者通常比青少年更快地提取β细胞。研究人员研究参与者中有40%是<10岁。考虑到β细胞丢失的一系列混杂因素，发病年龄是血清c肽时间下降的主要决定因素。大多数其他潜在疗法首先在成人人群中进行研究，因此无法可靠地排除成年潜伏性自身免疫性糖尿病（LADA）患者。第三，研究人员的研究能够在诊断后的前5周内招募所有儿童，允许胰岛在接近完全根除自身免疫β细胞之前接受干预。
研究人员的研究确定口服GABA是可以耐受的。这种“低剂量”名称的依据值得考虑。动物研究中使用的GABA的日剂量，主要是小鼠，是扫荡的，范围为0。25毫克至1500毫克/公斤。在FDA的限制下，研究人员的剂量为1克/米2（约35mg / kg）远低于几乎所有报告有益结局的体内研究。
图4：研究组的空腹和AUC胰高血糖素随时间的变化。
关于GABA/GAD串联比单独使用GABA更能减毒胰高血糖素的机制是推测性的。然而，GABA/GAD的组合以协同方式显着延长了移植β细胞的糖尿病NOD小鼠发生高血糖的时间。可以想象，GAD-明矾可能增加了环境胰岛细胞胰岛素浓度 - 尽管全身血清水平没有可检测到的变化 - 从而减少邻近的α细胞胰高血糖素释放。到目前为止，研究人员本可以单独包括一个GAD-明矾组，但是，由于之前的单中心和多中心GAD明矾研究，研究人员没有这样做。胰岛素原和胰岛素原/c肽比值是T1D中公认的β细胞应激标志物，可能与胰岛素原加工异常有关。研究人员研究了胰岛素原或胰岛素原/c肽比值是否通过GABA治疗或GABA联合使用来改变，因为它们在糖尿病中具有公认的免疫抑制作用，未发现统计学差异。同样，治疗组的基线或随后的糖尿病抗体滴度或阳性率没有差异，这对于为期一年的T1D试验来说并不意外。
考虑 DR3-DQ2 单倍型赋予 T1D 风险和病程的作用，研究人员相应地筛选了研究人员的研究队列。基于先前证明 HLA 单倍型对 GAD 明矾治疗具有特异性的证据，研究人员检查了HLA DR3-DQ2的存在与否是否改变了三个治疗组的主要结局。未发现差异;然而，可能需要更大的队列来检测统计差异。
总而言之，在这项每日两次GABA或与GABA/GAD共同治疗的前瞻性随机对照试验中，在T1D患者中，研究人员证明了GABA/GAD组的空腹和AUC胰高血糖素显着减少，而GABA组在12个月时没有显着减少。主要结局，即队列间空腹和膳食刺激的c肽没有统计学意义变化。尽管该试验在TID儿童中的GABA剂量必然较低，但结合依从性挑战，血清胰高血糖素的减少预示着进一步的研究可以想象保留β细胞功能或质量。事实上，在唯一一项使用GABA/GAD联合治疗的研究中，β细胞保存取决于剂量。最后，请记住GABA/GAD减弱了胰高血糖素的产生，这反过来可以扩大β细胞质量和/或改善葡萄糖稳态。例如，在糖尿病小鼠中，阻断胰高血糖素作用会使胰岛素阳性胰岛细胞量增加近8倍，并介导β细胞再生。就GABA在啮齿动物中较高剂量的免疫炎症缓和而言，并且研究人员的研究仅限于在T1D的儿科试验中相对低剂量的GABA剂量，增加GABA剂量或长效制剂可以提供足够长的，高于阈值的GABA浓度以保护胰岛细胞，特别是在1期糖尿病期间。
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