腈氧化物标记策略结合化学蛋白质组学实现先导化合物鉴定

英文原题：Oxidant-Induced Bioconjugation for Protein Labeling in Live Cells

供稿人：张贤睿 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology文章，标题为“Oxidant-Induced Bioconjugation for Protein Labeling in Live Cells”，文章的通讯作者是来自暨南大学的李正球教授和邢曦雯副教授。在这项工作中，作者报道了一种新的蛋白质标记策略，他们通过使用具有良好水溶性且毒性小的氧化剂苯基碘(III)二(三氟乙酸酯)（PIFA）处理肟，可以有效地生成一种与蛋白质反应的高反应活性中间体氧化腈。该中间体可以快速与靶蛋白的氨基酸残基发生偶联，从而能够对含肟的生物活性分子进行靶标鉴定。同时他们还观察到腈氧化物活性中间体对半胱氨酸残基具有出色的化学选择性，并且他们通过定量化学蛋白质组学成功地表征了超过4000个具有反应活性/可及性的半胱氨酸（图1）。

图1使用活性腈氧化物进行蛋白质标记

化学蛋白质组学是一项强大的技术，可用于研究人类蛋白质组中尚未被表征蛋白质的功能。但同时化学蛋白质组技术也需要依赖于合适的蛋白质标记偶联策略，目前的标记偶联策略有的利用具有紫外线响应的光交联分子，有的则是修饰了亲电反应基团的化学探针，通过与目标蛋白质形成共价键的形式来完成标记，在这项工作中，作者运用高价碘化物（PIFA）氧化化学探针中的肟基团，利用生成的腈氧化物对蛋白质进行标记，开发了一种新的可以应用于化学蛋白质组技术的蛋白质标记策略（图2）。

图2 不同的化学标记策略应用于化学蛋白质组技术

为了实现作者的设计，他们首先创建了一个基于肟的化合物 (W1–W10) 库，并入了不同的识别元素以调整蛋白质组反应性，同时嵌入了一个炔基报告标签用于下游检测。同时他们还合成了不含炔烃的腈氧化物 (W11–W18) 作为基于片段的配体发现 (FBLD) 策略的竞争分子。为了评估该策略在目标识别中的可行性，他们还同时制备了基于胆碱能药物的含炔探针 (W19)。为了确定氧化剂诱导的生物偶联反应是否可用于蛋白质标记，作者在氧化剂 PIFA的存在下，使用探针W1分别对BSA、活细胞以及细胞裂解液进行了标记实验验证，结果如图3B-F。

图3 探针分子合成以及标记验证实验

在确认氧化剂诱导的蛋白质标记可用于基于肟的化合物的目标鉴定后，作者研究团队又试图用这种亲电试剂和化学蛋白质组学方法鉴定该反应的反应性/可及性氨基酸残基。作者首先过对标记流程进行优化。之后为了表征结合位点，作者将探针标记的蛋白质用胰蛋白酶消化，然后直接通过 LC-MS/MS 进行分析。如图所示，随着BSA和KRAS G12C中分子量的增加，分别检测到76个和10个修饰位点。通过进一步分析表明，大多数结合位点是Cys和Lys残基。在鉴定过程中，他们还发现探针 W1 的氧化腈可以成功标记 KRAS G12C 的 12C 位点，对接实验也表明探针可以很好地容纳在蛋白质的结合口袋中。

图4 LC-MS/MS鉴定标记的氨基酸残基

之后，作者将这种亲电试剂应用于活细胞中的蛋白质标记。使用之前优化的标记流程，通过用PIFA处理W1–W10产生氧化腈，然后与活的 HepG2 细胞一起孵育。结果表明，W1和W9产生的氧化腈对内源性蛋白质的标记效率最高，表明引入不同元素的探针可以影响探针反应性。作者还通过使用相应的竞争者 W11 的氧化腈处理，标记条带在很大程度上被竞争掉，表明荧光条带是由探针结合产生的，而不是由非特异性标记产生的。作者还测试了包括 A549、HeLa、MCF-7、H1975 和 MDA-MB-231 细胞，表明该反应可用于不同的细胞条件。这些数据证明了腈氧化物具有出色的原位标记效率，并且在低探针浓度下观察到了显着的特异性。

图5 活细胞中的蛋白质标记结果

接下来，作者进行了定量蛋白质组学研究，以确定氧化腈的蛋白质靶标。作者使用带有稳定同位素氨基酸 (SILAC) 标记的 HepG2 细胞的与 W1的氧化腈处理并通过 LC-MS/MS 进行分析。用 DMSO 或竞争者处理的样品用作对照，以区分真实标记与背景标记。他们鉴定到了许多与各种癌症相关的重要蛋白质，包括线粒体醛脱氢酶 (ALDH2)、DNA-（脱嘌呤或脱嘧啶位点）核酸内切酶 ( APEX1)、peroxiredoxin-6 (PRDX6)、ATP 依赖性 RNA 解旋酶 DDX3X (DDX3X)、UDP-葡萄糖 6-脱氢酶 (UGDH)、谷胱甘肽 S-转移酶 omega-1 (GSTO1) 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 。这些鉴定到的蛋白质主要位于细胞胞浆和细胞核中。作者通过Weatern Blot对鉴定到的蛋白质ALDH2、GSTO1 和 GAPDH进行了进一步验证。这些标记和成像结果表明，该探针可能是分析活细胞中 GAPDH 表达和功能的有用工具。作者还进行了热位移分析实验，结果表明，当温度升高时，探针的结合会破坏蛋白质的稳定性。而抑制测定表明，探针 W1 产生的氧化腈对 GSTO1 和 GAPDH 显示出适度的抑制作用。这些结果表明，腈氧化物可能是用于开发新型共价抑制剂的新型亲电子弹头。对 W1 与 PIFA 和 IA-炔烃之间的蛋白质组分析进行了比较，尽管两种探针都鉴定到许多相同的到蛋白质，但 W1 + PIFA 检测到了额外的 17.8% 的特定蛋白质，展示了该探针的可以作为传统方法的良好补充。

为了表征活细胞中氧化氮的结合位点，作者进一步进行了串联正交蛋白裂解 (TOP)-ABPP 实验。通过 LC-MS/MS 分析探针标记的肽，作者发现其中约 2080 种蛋白质中共有 4480 个不同的位点携带结合探针，所有位点中高达 81% 的目标是半胱氨酸残基，证明了该方法出色的化学选择性。

图6 定量蛋白质组学研究确定氧化腈的蛋白质靶标

为了评估探针修饰残基的内在反应性和功能性，作者进一步进行了isoTOP-ABPP实验。作者将高低两个浓度的探针分别与 SILAC 标记的 HepG2 细胞孵育。通过高分辨率 LC-MS/MS 分析。结果表明，在低和高探针浓度实验中同时检测到来自 722 种蛋白质的 859 个氨基酸残基。作为对比的是，传统的半胱氨酸反应探针未检测到大约 20% 的残基，从而证明了这种反应弹头的互补效用。其中，乙酰辅酶A乙酰转移酶(ACAT1)的C126位、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A(DNMT3A)的C710位、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3P)的C152位等60个活性半胱氨酸残基 和谷胱甘肽 S-转移酶 omega-1 (GSTO1) 的 C32 具有公认的功能。同时，在鉴定到的蛋白质中，76% 的蛋白质不在 Drugbank 数据库中，并且仍然缺乏已知的小分子配体。作者通过标记转染的突变蛋白进一步验证了已识别的位点：ACP1 的 C18、CPPED1 的 C54、PRDX6 的 C47 和 UBA1 的 C632。晶体结构分析表明，许多配体位于活性结合口袋中，这些结果表明，由该探针引起的修饰可能会破坏蛋白质功能。

图7 isoTOP-ABPP实验评估探针修饰残基的内在反应性和功能性

最后，进行基于片段的配体筛选实验（FBLD）以鉴定功能残基并研究复杂蛋白质组中的片段反应性。结果表明，含有吲哚和喹啉结构的片段 W13 和 W15 的氧化腈对探针标记影响很小，而由含有苯并恶烷、氮杂吲哚、吡啶和 苯甲腈分别在标记谱中显示出显着的竞争，表明这些是 W1 的氧化腈结合位点的新型配体。之后作者通过定量蛋白质组学来鉴定相应配体的高反应性位点。同时也通过抑制测定证实，W14 的氧化腈对 GSTO1 和 GAPDH 表现出比 W1 的氧化腈更高的抑制活性。对接实验也表明相应的口袋可以很好地容纳片段 W12 和 W14，表明这些片段可能是这些重要蛋白质命中的新配体。这些结果证实，通过结合这些特定的氨基酸残基，氧化腈衍生物可以成为这些蛋白质靶标的新型先导化合物。

图8 基于片段的配体筛选实验

最后对这项工作进行一个总结：作者开发了一种新的生物相容性标记蛋白质的方法。通过采用氧化腈是作为亲电弹头，可用于鉴定蛋白质组范围内活性半胱氨酸。氧化腈是第一个可以在低探针浓度下特异性标记 GAPDH 的化学探针，并且可以作为表征其在活细胞中的表达和功能的独特工具。作者使用该探针结合定量蛋白质组学方法，确定了一系列具有注释或未注释功能的高反应性残基。通过 FBLD 方法鉴定了一组对应于标记残基的新型配体，它们可能是这些鉴定这些蛋白质的新型先导化合物。这种新的标记策略可以补充现有半胱氨酸反应探针的工具箱。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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