今天带来的思路来自“LSD1 deletion decreases exosomal PD-L1 and restores T-cell response in gastric cancer”，2022年3月在Molecular Cancer（IF 41.444）上线。主要讲的是LSD1的缺失能够降低外泌体中PD-L1的表达并恢复胃癌中的T细胞反应。
文献链接：LSD1 deletion decreases exosomal PD-L1 and restores T-cell response in gastric cancer - PMC (nih.gov)
文章导读
LSD1在2004年被表征为第一个组蛋白去甲基化酶，参与广泛的生物过程，包括细胞发育、分化、生长、迁移和干性，且在多种癌症中充当癌基因。LSD1 的表达已被证明在胃癌（GC） 中升高并促进了 GC 的增殖和转移，而用其抑制剂治疗则抑制了 GC 细胞的生长、侵袭和迁移。LSD1还可以通过调节由NK细胞、巨噬细胞极化介导的肿瘤微环境来促进肿瘤的发展过程。在这篇文章中，通过比较 LSD1 在免疫缺陷小鼠和正常小鼠中的功能，发现 LSD1 通过抑制 GC 中的T细胞活性来维持肿瘤的生长，而LSD1缺失降低了 PD-L1 的总表达。
外泌体是由正常细胞和癌细胞分泌的一类直径为 30-150 nm 的小囊泡，有报道称外泌体可通过传递PD-L1以抑制抗癌免疫。在此项研究中，确定了PD-L1被GC细胞衍生的外泌体所携带，并且发现GC细胞在 LSD1 被沉默时维持细胞膜上PD-L1的表达并减少外泌体中的PD-L1。同时，LSD1缺失可以通过减少外泌体中PD-L1的含量以及抑制PD-L1通过外泌体向其他癌细胞转运，从而恢复GC微环境中T细胞的杀伤功能，逆转免疫抑制。
这些结果揭示了LSD1抑制GC中肿瘤免疫的新机制，并可能为以LSD1作为治疗靶点的GC免疫治疗提供新的策略。
文章内容
01
LSD1沉默通过激活GC中的T细胞反应来抑制肿瘤生长
首先通过 TIMER2.0 分析 LSD1 和免疫细胞特征之间的相关性，发现LSD1 与肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞呈负相关（图 1a）。使用TCGA数据库的进一步分析显示 LSD1 的 mRNA 与 GC 中的 CD8 和 CD3 mRNA 表达呈负相关（图 1b）。在人GC细胞系BGC-823和MGC 803以及MFC细胞系中敲除（KO）LSD1后接种到 615 只小鼠和 T 细胞缺陷型 BALB/c 裸鼠中，结果显示，在 BALB/c 裸鼠中，MFC LSD1 KO 组的肿瘤重量和体积与 MFC 组相当，而在 MFC LSD1 KO 组中，615 只小鼠的肿瘤几乎完全根除（图 1c 和 d）。这些结果表明 LSD1 可能通过抑制 T 细胞反应来维持肿瘤生长。此外，人类 GC 细胞与抗 CD3/CD28 磁珠激活的 T 细胞共孵育的结果表明，无论 LSD1 是否被敲除，BGC-823 和 MGC-803 细胞在体外都能稳定生长（图 1e），而当LSD1不存在时，这两种癌细胞系更容易被活化的T细胞杀死（图1f）。通过分析图 1c 中 615 只小鼠的剥离肿瘤，发现LSD1 的缺失导致 CD8+ T 细胞浸润增加（图 1g），这与图 1a 中的结果一致。这些结果表明 LSD1 是GC中T细胞反应的抑制因子，LSD1 缺失可能通过在体外和体内促进T细胞杀伤能力显著抑制GC细胞的生长。
图1
02
GC组织样本中LSD1与CD8呈负相关，与PD-L1呈正相关
IHC结果显示LSD1 在 GC 组织中过表达（图 2a 和 2b），与 CD8 呈负相关（图 2c）。癌组织中 LSD1 和 PD-L1 的表达高于相邻组织中的表达（图 2d），并且 PD-L1 与 LSD1 呈正相关（图 2e）。在 TCGA 数据库中，PD-L1 表达也与 GC 中的 LSD1 mRNA 表达呈正相关（图 2f）。这些结果提示 LSD1 和 PD-L1 之间可能存在调节关系。
图2
03
LSD1 的抑制下调 GC 中的 PD-L1
对一组 GC 细胞中的总 PD-L1 和膜 PD-L1 的定量分析结果显示，在不同的 GC 细胞系中总 PD-L1 和膜 PD-L1 的表达明显不均匀（图3a、b）。当 LSD1 被敲除时，PD-L1 mRNA和蛋白表达水平均下调（图3c-f），多泡体的数量减少（图3g和h），同时多泡体标志蛋白TSG101 表达降低（图 3i）。这些结果表明，LSD1缺失可降低PD-L1总表达并且减少PD-L1通过多泡体在细胞外的分泌。
图3
04
LSD1缺失下调GC中的外泌体PD-L1
GC 细胞衍生的外泌体的大小范围为 30 至 200 nm（图 4a 和 b）。使用通过蔗糖梯度离心纯化的外泌体进行的分析，发现外泌体标记 CD63、ALIX 和 CD9 在 20%-40% 蔗糖部分中传播，并且 PD-L1 与这些外泌体标记共定位（图 4c）。PD-L1 被包装到来自 GC 细胞的外泌体中，并且 PD-L1 在GC细胞外泌体中积累（图 4d）。在BGC-823 和 MGC-803 细胞中敲除LSD1后（图 4e、4f），外泌体 PD-L1 减少，表明 LSD1调节外泌体 PD-L1 的积累。此外，从 LSD1 缺失的 BGC-823 和 MGC-803 细胞收集的外泌体也比野生型细胞的外泌体含有更少的 PD-L1（图 4g 和 h）。同时，当 LSD1 被敲除时，GC 细胞衍生的外泌体的浓度降低（图 4i）。抑制外泌体分泌可以诱导 BGC 823 细胞膜 PD-L1 的积累，还可以重新诱导 LSD1 缺失的 BGC-823 细胞膜 PD-L1 的积累（图 4j）。这些结果表明，PD-L1 存在于 GC 细胞衍生的外泌体中，并且 LSD1 敲除减少了总细胞 PD-L1 的量，但保留了膜 PD-L1，以及减少了外泌体分泌和外泌体 PD-L1 的积累。
图4
05
LSD1缺失逆转GC衍生的外泌体PD-L1的直接T细胞反应抑制作用
PD-1/PD-L1结合实验显示，用 PKH26 标记的 GC 细胞的外泌体与PD-1结合，当LSD1 缺失时，这种结合可以显著消除（图 5a）。同时，GC 细胞衍生的外泌体可以直接与 T 细胞结合，并且 LSD1的缺失消除了这种相互作用（图 5b）。当用GC细胞外泌体（B-EXO）处理T细胞时，CD8+ T 细胞中的 CD69 有明显的下调，而沉默LSD1的GC细胞外泌体（B KO-EXO）或 PD-L1 抗体或 PD-1 重组体阻断外泌体 PD-L1 的作用挽救了 CD8+ T 细胞中 CD69（CD8+ T 细胞的激活标志物）的抑制表达（图 5c）。在B-EXO存在下T细胞增殖减少，但在 LSD1 被敲除时没有这种情况发生，表明 LSD1的缺失去除了B-EXO的免疫抑制功能（图 5d）。为了进一步证实外泌体可以调节 T 细胞的 GC 细胞杀伤能力，活化的外周血单核细胞（PBMC）与 GC 细胞共培养，并在存在或不存在 LSD1 的情况下用源自GC细胞的外泌体处理。结果表明，B-EXO可以减少 T 细胞杀伤以保持 GC 细胞存活，而B KO-EXO由于 PD-L1 的低表达而对 T 细胞杀伤没有影响（图 5e 和 f）。同时，IL-2（图 5g）、IFN-γ（图 5h）和 TNFα（图 5i）这三种在 T 细胞活化过程中分泌的主要反应性细胞因子也可以被 B-EXO 抑制并被 B KO-EXO 挽救。这些结果一致表明，源自 GC 细胞的外泌体可以直接抑制 TCR 介导的 T 细胞活化，并且该现象取决于由LSD1 调节的外泌体 PD-L1。
图5
06
LSD1缺失通过影响PD-L1在靶细胞中的表达来逆转GC细胞衍生的外泌体对T细胞反应的抑制作用
将 B-EXO 和 B KO-EXO 用荧光 PD-L1 抗体染色并与GC细胞孵育，结果显示外泌体 PD-L1被转运到目标GC细胞中（图6a）。B-EXO 可以诱导靶细胞膜 PD-L1 的积累，而用 B KO-EXO 处理的GC细胞没有显著的 PD-L1 积累（图 6b），在PD-L1的总表达上也看到了类似的效果（图 6c 和 d）。当用 B-EXO 处理时，PD-1 与细胞表面的结合显著增加，而 PD-1 在用 B KO-EXO 处理的细胞上的结合保持不变（图 6e和f)。因此，当活化的 T 细胞与用 B-EXO 处理的GC细胞共孵育时，CD3+CD8+ T 细胞中 CD69 的表达降低，但在用 B KO-EXO 处理的细胞组中则没有（图 6g）。用 B-EXO 处理的 GC 细胞旨在逃避T细胞杀伤，而 B KO-EXO 对癌细胞的T细胞杀伤敏感性没有显著影响（图 6h）。这些结果表明，外泌体中的 PD-L1 可以转运到其他癌细胞中，从而诱导肿瘤细胞从 T 细胞中免疫逃逸，而 LSD1 缺失降低了 GC 细胞衍生的外泌体的免疫抑制功能，这突出了 LSD1 作为潜在的免疫抑制因子用于肿瘤免疫治疗的潜力。
图6
07
来自 LSD1缺失GC 细胞的外泌体通过体内外泌体 PD-L1 促进 T 细胞介导的肿瘤免疫
鉴于 GC 细胞衍生的外泌体在体外抑制了T细胞活化，作者进行了体内实验以验证这一结论。结果发现，LSD1 的缺失显著抑制了小鼠的肿瘤生长。注射来自小鼠前胃癌细胞（MFC）的外泌体的小鼠（MFC+CON EXO 组）的肿瘤明显大于未治疗肿瘤的小鼠（MFC 组），而注射了来自 MFC LSD1 KO 细胞的外泌体的小鼠（MFC+KO EXO 组）的肿瘤比这两组小得多（图 7a-c）。此外，当来自 MFC 和 MFC LSD1 KO的外泌体与PD-1一起孵育以阻断外泌体 PD-L1（MFC+CON EXO+PD-1 组和 MFC+KO EXO+PD-1 组）时，MFC+CON EXO+PD-1 组、MFC+KO EXO+PD-1 组和 MFC+KO EXO组的肿瘤体积和重量没有显著差异（图 7a-c）。与 MFC 组相比，MFC LSD1 KO 组中 CD8+ T 细胞的比例显着增加，而 LSD1 KO 细胞衍生的外泌体也促进了CD8+ T细胞的比例（图 7d）。另一方面，当外泌体 PD-L1 被 PD-1 重组体阻断时，MFC+CON EXO+PD-1 组中 CD8+ T 细胞的比例高于 MFC+CON EXO 组（图 7d）。同时，MFC+KO EXO 和 MFC+KO EXO+PD-1 组之间 CD8+ T 细胞的比例没有显着差异（图 7d）。对于这些肿瘤中的肿瘤浸润性 CD3 和 CD8 表达（图 7e 和 f）以及细胞因子 IL-2 和 IFN-γ 的表达（图 7g 和 7h）也获得了趋势一致的结果。此外，携带 MFC LSD1 KO 细胞的小鼠血浆中外泌体 PD-L1 的表达远低于携带 MFC 细胞的小鼠血浆中的表达（图 7i），这表明 LSD1 具有通过外泌体PD-L1调节全局免疫反应的潜力。总的来说，这些结果表明 LSD1 缺失可以抑制GC小鼠模型中 MFC 细胞的增殖。同时，在依赖供体细胞中存在 LSD1 的同时，外泌体可以调节 MFC 细胞增殖，其作用取决于外泌体 PD-L1 介导的体内 T 细胞免疫。
图7
小结
该项研究发现 LSD1 缺失通过减少外泌体中 PD-L1 的积累来增强T细胞活性，从而抑制肿瘤生长。更重要的是，使用外泌体作为载体，LSD1 通过外泌体 PD-L1 阻碍其它癌细胞的 T细胞反应，而LSD1的缺失则恢复了T细胞功能。这些发现揭示了LSD1通过外泌体PD-L1调节T细胞免疫的新途径，并为以LSD1为靶点的GC免疫治疗提供了新的策略。
转自：“学术查”微信公众号
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