以下文章来源于中洪博元生物 ，作者中洪君
肿瘤细胞转移主要包括以下5个过程：原位侵袭（Local invasion），肿瘤细胞内渗（Intravasation），循环系统存活（Survival in the circulation），肿瘤细胞外渗（Extravasation），形成转移灶（Micrometastasis formation）等。
其中细胞侵袭便发生在第一步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进入血管、淋巴管的过程，后期才开始进行转移。
（肿瘤细胞转移过程，来源DOI:10.1016/j.cell.2011.09.024）
肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤相关信号通路、药物治疗、靶向治疗、致癌/抑癌基因等肿瘤学研究的一个重要指标。
因此肿瘤细胞侵袭能力检测在肿瘤研究中是常规实验，其中Transwell实验是检测细胞迁移能力和侵袭能力常用的实验手段。
Transwell实验介绍
Trans可译为转移，穿过，而well则为小室的意思，外形如同一个小杯子，杯底有通透性的膜（孔径0.1－12.0µm，细胞侵袭一般用8.0、12.0μm）。
Transwell实验的基本原理就是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
（来源于互联网）
在肿瘤相关研究中，利用Transwell小室检测肿瘤细胞的迁移和侵袭能力是十分常见的功能学实验，主要研究肿瘤细胞侵袭和转移机制及各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响。
肿瘤细胞接种在上室无血清的培养基里，下室加入胎牛血清（FBS）或某些特定的趋化因子，为了获得更多的营养，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，通过计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
与肿瘤细胞迁移实验不同的是，肿瘤细胞侵袭实验需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质，细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）要把基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似），最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。
（DOI:10.1007/s00383-013-3369-6）
Transwell侵袭实验
有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。
实验材料（提前1天准备）
（1）Transwell小室
根据待测细胞体积大小选择合适孔径的小室。常用的为8.0μm孔径，如果细胞体积较大可以考虑用12μm孔径。
（2）细胞培养板：常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中，以24孔板最常用。
（3）基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel。
Matrigel胶于-20℃保存，为固体，4 ℃融化成液体，室温凝结成胶状，且不可逆。实验时需提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜，实验前转移到冰盒中
（4）上层培养液：采用无血清培养基，为维持渗透压，可以加入0.05%-0.2%牛血清白蛋白（BSA）；
（5）下层培养液：采用含5%-10%胎牛血清（FBS）的培养基，具体浓度根据细胞转移力而定，转移力弱的细胞可适当提高FBS浓度。也可用趋化因子，如将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子。
（6）4%多聚甲醛固定液
（7）结晶紫染液
实验步骤
（一）基质胶铺板
在4℃条件下（冰上操作）将Matrigel胶用无血清的细胞培养基或PBS缓冲液进1:8行稀释（具体稀释比例需要摸索，根据细胞产生MMPs的量来决定）。
取60μl均匀添加到Transwell小室（Transwell chamber）底部膜的上室面，37℃培养箱中孵育3h，使基质胶聚合成薄膜。
孵育后将上室中多余液体吸掉，在每孔中加入100μl无血培养基后，于培养箱放置30min，进行基底膜水化。
Tips:
（1）将枪头沿小室内壁将Matrigel轻轻打出，不要产生气泡，切忌戳到小室滤膜；
（2）加入的Matrigel胶的体积不可太大，把聚碳酸酯膜浸湿即可；
（3）Matrigel在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头、小室等都应提前在4°C预冷。
（4）铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡。
（二）制备细胞悬液
待测细胞培养至对数生长期，用0.25%胰酶消化细胞2-3min，1000rpm离心细胞3min，离心后弃去上清，用PBS洗1-2遍，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度至1-10×105/ml（根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数）。
Tips:
（1）如果细胞迁移能力较弱，可在细胞接种前，先无血清饥饿过夜或提高细胞接种密度。
（2）如果细胞量过多，穿过膜的细胞会过多，容易造成计数困难；如果细胞量过少，可能还没有到检测的时间点，所有细胞都已穿过，容易造成假阳性结果，因此把握接种密度很重要，需设置浓度梯度进行摸索。
（三）接种细胞
在24孔板下室一般加入500-650μL含5%-10%FBS或趋化因子的培养基，然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液100-200μL加入上室，最后放入培养箱中培养12-48h（根据癌细胞侵袭能力而定）。
Tips:
（1）尽量避免气泡的产生：下层培养液和小室间常会有气泡产生，会影响下层培养液的趋化作用。因此一旦出现大气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板；
（2）注意细胞一定要接种均匀，建议沿着壁缓慢加入；
（3）培养时间的选择除了要考虑到细胞的转移能力以外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视，如某些药物会抑制细胞的增殖。
（四）检测穿过的细胞数
（计数的结果可做成统计图，辅助呈现数据）
1、直接计数法
（1）“贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。
可以通过给细胞染色（如结晶紫染色、台盼蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色），在镜下计数细胞。
①细胞固定
用镊子小心取出小室，吸干上室培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600μL，将小室放入后固定20-30min。
②细胞染色
取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl 0.1%-0.2%结晶紫的孔中染液的孔中，染色15-30min。除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检计数。
Tips:
固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破。
使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。
③细胞计数
轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出小室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。用小镊子小心揭下膜，底面朝上，适当风干后，移至载玻片上用中性树胶封片。在高倍显微镜下进行观察和拍照，随机选取5个视野(上、下、中央、左、右各1个)计数呈紫色的阳性细胞，统计结果。
Tips:
充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。
小室和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组。
膜上本来就有小孔（白色透明的球形），所以切不可把小孔当做是细胞计数。
计数细胞时，Transwell膜中心的视野和膜边缘的视野都需要选择，以便准确体现穿过整个膜的细胞数。
（2）“非贴壁”细胞计数
由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。这种情况下可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数。
2、间接计数法
主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数的情况。如：
（1）MTT法
噻唑兰（MTT），可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的甲替结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法用于一些生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等。
（2）结晶紫检测
原理与MTT法也类似。在上述染色后，用3%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，取洗脱液在酶标仪上测量OD值（570nm），间接反映细胞数目
■ 细胞不侵袭可能原因
（1）首先明确细胞是否具备侵袭能力。建议实验前用酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，特别是MMP-2的表达。
（2）为了让实验结果更明显，可在无血清的情况下，让细胞饥饿12-24h，再进行实验。
（3）很可能是上室混有高浓度血清或者是小室孔径不对。要核对小室的孔径，避免与孔径较小的小室用混。
■ 染色后细胞分布不均一可能原因
转自：“医学科研小坑”微信公众号
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