睾酮是雄性生殖系统分化发育的重要物质、可促进精子的发生、成熟及蛋白质的合成[1]。任何因素导致睾丸间质细胞数量减少或活性下降将引起雄激素合成量不足。如睾丸间质细胞的过量凋亡，使睾酮的分泌量明显下降，进而促进生精细胞的凋亡，导致男性不育[2]。睾酮缺乏症是指生物学上缺乏睾丸激素和精子产生从而导致性腺轴功能减退的一种症状[3]。现代中医认为性腺轴功能衰退与肾虚证关系密切，尤其是男性睾丸间质细胞功能衰退[4]。采用补肾法可以升高肾虚证患者血清睾酮水平[5]，从而治疗此类疾病。临床有关生殖系统的肾阳虚证通常采用补肾壮阳类中药如巴戟天、淫羊藿等，药理实验表明这些补肾壮阳类中药对睾酮的合成与分泌均有调节作用。因此补肾壮阳类药物用于睾酮缺乏症治疗具有重要意义。
恩施巴戟为茜草科植物四川虎刺Damnacanthus officinarum Huang的干燥根[6]，又名湖北巴戟天，是湖北省土家族习用的补肾壮阳类药材，主要用于治疗肾虚腰痛、阳痿遗精等。其肉质、链珠状根与巴戟天相似，且在成分和功效上有诸多相似之处[7]。因其临床疗效确切、有一定的资源量，将其收入湖北省食品药品监督管理局组织制定的湖北省地方习用药材第一部技术标准《湖北省中药材质量标准》2009年版，并保留于2018年版。药理研究表明，恩施巴戟能够促进小鼠生长，增强小鼠抗疲劳能力，并且具有助阳作用[8]。据报道，恩施巴戟的主要成分为蒽醌类、环烯醚萜类、多糖类等，其中环烯醚萜类成分在改善肾阳虚证过程中发挥重要作用[9]，其中水晶兰苷质量分数可至1.872%，为恩施巴戟的主要成分[10]。同时，本课题组在动物实验中发现恩施巴戟提取物能够提高小鼠血清中睾酮的含量，但其具体作用机制有待进一步研究。因此，本研究通过网络药理学[11]和分子对接技术预测其治疗睾酮缺乏症的靶点、活性成分和分子机制，并采用LC-MS/MS技术和体外大鼠睾丸间质细胞模型进一步验证网络药理学结果，为恩施巴戟的进一步研究与开发提供参考。
1材料
1.1动物
SPF级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购自湖北省实验动物研究中心，动物许可证号SCXK（鄂）2020-0018。所有大鼠均在标准实验室条件下饲养，温度20～24 ℃，相对湿度40%～60%，明暗循环12 h。本研究的实验方案经湖北中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批准号SYXK2017-0067）。
1.2药材
恩施巴戟采于湖北省恩施土家族苗族自治州咸丰县高乐镇田坝村，经湖北省中医药大学刘义梅教授鉴定为茜草科植物四川虎刺D. officinarum Huang的干燥根。
1.3药品与试剂
DMEM/F12培养基（批号WH0021K191）购自Procell公司；MTT（批号MKBL6647V）购自美国Sigma公司；胶原酶I（批号I1904MG100）购自BioFRoxx公司；胎牛血清（批号21110704）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；马血清（批号SH3007402）购自Hyclone公司；双抗（批号MA0110）、Western及IP细胞裂解液（批号MB9900）购自大连美仑生物技术有限公司；2.5%胰酶（批号2323073）购自美国Gibco公司；Percoll分离液（批号69120070）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号BL521A）购自Biosharp公司；水晶兰苷对照品（批号5945-50-6，质量分数≥98%）购自成都植标化纯生物技术有限公司；Forskolin（Fsk，批号GC11920）购自Glpbio Technology公司；睾酮ELISA试剂盒（批号20220106）购自南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂（批号W9712）、反转录试剂盒（批号W0106）、Real Universal彩色荧光定量预混试剂SYBR Green（批号S7918）购自天根生化科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、类固醇生成急性调控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）、胆固醇侧链裂解酶（cholesterol side-chain cleavage enzyme，Cyp11a1）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）引物由生工生物工程股份有限公司合成；GAPDH抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购自Servicebio公司；Star抗体购自ABclonal公司。
1.4 仪器
HH-6型数显恒温水浴锅（常州郎越仪器制造有限公司）；Synergy 2型酶标仪（美国Bio-Tek公司）；BNP-80CH型CO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；IX-73型荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；LightCycler 480II型荧光定量PCR仪（罗氏诊断产品有限公司）；Xevo G2-XS QTOF飞行时间质谱仪（美国Waters公司）；PowerPacTM Basic型电泳仪、Mini Trans-Blot Cell型蛋白转印仪（美国Bio-Rad公司）；FCQ型荧光化学发光凝胶成像仪（上海普诺森生物科技）。
2 方法
2.1 恩施巴戟的网络药理学研究
查阅文献，将所获得的恩施巴戟中的化学成分，通过数据库PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）确认结构，导入到SwissTargetPrediction（http:// www.swisstargetprediction.ch/）进行预测，在Uniprot（https://www.uniprot.org/）中校正靶点。再通过TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www. drugbank.ca/）、GeneCards（https://www.genecards. org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/home/）等与疾病靶点相关的数据库，获得睾酮缺乏症相关的靶点。
将以上2种靶点导入韦恩图工具（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中取交集，用STRING数据库（https://string-db.org/）将蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）综合得分＞0.9作为筛选条件，利用Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络图，筛选出潜在靶点。将化学成分与潜在作用靶点构建“活性成分-核心靶点”关联网络图，然后根据DAVID数据库（https://david. ncifcrf.gov/）进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。
2.2 恩施巴戟活性成分与潜在靶点分子对接
分别在TCMSP数据库（https://tcmsp-e.com/）和PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载活性成分和潜在靶点的结构，然后用AutoDockTools1.5.7软件对蛋白进行去水、加氢等处理，利用插件“autogrid”及“autodock”进行活性位点对接，并计算结合能来评估活性成分与潜在靶点之间的结合活性，最后以结合能≤−5 kJ/mol作为筛选标准，用PyMOL 2.5.3软件展示其结构模式。
2.3恩施巴戟提取物的成分分析
2.3.1 色谱条件 Welchrom-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～0.5 min，99% A；0.5～14.0 min，99%～85% A；14.0～18.0 min，85%～70% A；18.0～20.0 min，70%～40% A；20.0～22.0 min，40%～20% A；22.0～25.0 min，20%～0 A；柱温35 ℃；体积流量0.4 mL/min；进样量2 μL；检测波长240 nm。
2.3.2 质谱条件 采用ESI离子源，正、负离子模式下采集数据；MSE模式采集一级质谱离子和二级质谱离子，采集范围均为m/z 100～1200；电喷雾电压3000 V；脱溶剂温度500 ℃；一级碰撞能量10 eV，二级碰撞能量35 eV；碰撞能量波动±10 eV。
2.4样品制备
取恩施巴戟药材粉末2.5 g，分别加入10倍量的水及50%、70%、95%乙醇，85 ℃加热回流2 h，滤过，滤渣再分别加入10倍量溶剂回流1 h，滤过，合并2次滤液，挥至浸膏状，冷冻干燥，得到药材不同提取物粉末。将所得提取物粉末用二甲基亚砜溶解，配制成100 mg/mL的母液，即得到水提取物、50%乙醇提取物、70%乙醇提取物、95%乙醇提取物。水晶兰苷对照品用二甲基亚砜溶解，配制成50 mmol/L的母液。Fsk用二甲基亚砜溶解，配制成10 mmol/L的母液。
2.5 睾丸间质细胞分离纯化及纯度鉴定
将雄性大鼠处死，取出睾丸，置于冰上的PBS中，清洗3次。将睾丸脱膜，剪碎，放入离心管中，用DMEM/F12培养基清洗剩余残留。向离心管中加入适量DMEM/F12培养基，34 ℃震荡15 min；再加入0.05%胶原酶I，37 ℃震荡15 min，加入等体积DMEM/F12培养基（含8%马血清、2%牛血清、1%双抗）终止消化，用70 μm尼龙滤网滤过，取滤过后的组织重复操作1次。合并滤液，离心后除去上清，重复2次。收集所有细胞，加到不同密度梯度的离心液中[12]（从上往下依次为5%、30%、58%、70%），4 ℃、3000 r/min离心30 min，吸取58%处条带。加入适量DMEM/F12培养基，离心后除去上清，重复2次。收集以上细胞，重悬，加到DMEM/F12培养基中，放入培养箱中，24 h后换液，继续培养，及时换液。
将所得的原代细胞消化，取50 μL细胞悬液，加入200 μL现配的3β-HSD进行染色，孵育2 h，于显微镜下观察，计算阳性染色细胞数，鉴定细胞纯度。
2.6 MTT法检测睾丸间质细胞存活率
将对数生长期的睾丸间质细胞消化，计数，配制成细胞悬液，按照8×103个/孔均匀铺在96孔板中。待细胞贴壁后，分别加入恩施巴戟不同提取物和水晶兰苷，作为给药组。另设对照组和空白组，对照组加入与给药组等体积含血清的培养液，空白组不含细胞只加入培养液，每组设3个复孔。培养24 h，除去上清液，每孔加入100 μL MTT稀释液，于培养箱中孵育4 h，加入100 μL的二甲基亚砜，震荡，使结晶溶解，用酶标仪测定490 nm处的吸光度（A）值，计算细胞存活率。
2.7睾丸间质细胞睾酮分泌量测定
采用大鼠睾酮ELISA试剂盒检测样本中的睾酮的含量。将对数生长期的睾丸间质细胞，配制成悬液，按照4×104个/孔接种在12孔板。待细胞贴壁后，加入恩施巴戟提取物和水晶兰苷，作为给药组，另设对照组和阳性组，对照组加入与给药组等体积含血清的培养液，阳性组加入10 μmol/L的Fsk。培养24 h，收集上清，2500 r/min离心20 min，取上清，按试剂盒说明书测定每孔睾酮分泌量。
2.8 qRT-PCR检测相关基因表达
取对数生长期的睾丸间质细胞，按照2.5×105个/孔接种在6孔板。加入恩施巴戟95%乙醇提取物和水晶兰苷作为给药组，另设对照组和阳性组，对照组加入与给药组等体积含血清的培养液，阳性组加入10 μmol/L的Fsk。使用TRIzol试剂提取细胞的总RNA，通过反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA，再将所得cDNA为模板进行qRT-PCR分析。引物序列见表1，以GAPDH为内参。
2.9 Western blotting检测蛋白表达
按照“2.8”项下方法处理细胞，置冰上提取睾丸间质细胞蛋白，BCA法定量蛋白，蛋白变性处理后电泳、转膜，封闭后加入相应一抗（用4%牛血清白蛋白按照1∶1000稀释），孵育过夜；洗涤后加入二抗（用TBST按照1∶3000稀释），室温孵育；洗涤后显影。
2.10 数据处理
利用Graph Pad Prism软件运用Dunnett’s t检验对组间差异进行分析，并绘制柱形图；利用mELISA软件处理试剂盒数据，采用四参数方程，计算各组睾酮分泌量；采用MassLynx V4.1软件对LC-MS/MS数据进行处理，结合参考文献中的保留时间和碎片离子，对各主要分子离子峰进行归属。
3 结果
3.1 恩施巴戟网络药理学分析
3.1.1 恩施巴戟的PPI网络构建 结合文献报道，共得到恩施巴戟36个成分（表2），总成分对应的作用靶点为1021个。整合多个疾病数据库，共得到睾酮缺乏症潜在靶点3401个。通过韦恩图将恩施巴戟的成分靶点与睾酮缺乏症疾病靶点进行映射，共获得397个共同交集靶点，构建PPI网络，见图1。选取度值排名前10名的靶点，综合筛选，获得与睾酮合成紧密关联的6个靶点，分别为丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、组蛋白乙酰转移酶p300（histone acetyltransferase p300，EP300）、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基1（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α亚型（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、转录因子Jun（transcription factor Jun，JUN）。
3.1.2 恩施巴戟“活性成分-潜在靶点”网络构建 将36个恩施巴戟活性成分和397个潜在作用靶点进行“活性成分-潜在靶点”网络构建，结果见图2。度值越大，节点越大，说明该节点在网络中越重要，水晶兰苷为恩施巴戟中的主要活性成分之一。
3.1.3 恩施巴戟的KEGG通路富集分析 通过富集分析，共获得178条KEGG通路，选择前20位结果绘图，见图3。其中富集程度较高，且与睾酮合成紧密关联的条目为环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路、MAPK信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路等。
3.2水晶兰苷与关键靶点的分子对接
选择关键靶点MAPK1、EP300、PIK3R1、PIK3CA、AKT1、JUN，以恩施巴戟的主要成分水晶兰苷为对象进行分子对接（表3）。水晶兰苷与选择的关键靶点有较强的结合活性，结合能均小于−5 kJ/mol，与MAPK1的结合能最强，其次是EP300、JUN、PIK3CA、AKT1、PIK3R1。水晶兰苷与关键靶点的相互作用见图4。
3.3 恩施巴戟LC-MS/MS分析
恩施巴戟提取物的LC-MS/MS成分分析总离子图见图5。通过数据解析，与文献报道[13-20]比对，共鉴定出10个化合物（表4），包括环烯醚萜类成分6个、蒽醌类成分4个，其中丰度最高的峰为水晶兰苷，与网络药理学分析结果一致。
3.4 睾丸间质细胞模型验证
3.4.1 睾丸间质细胞的分离纯化及纯度鉴定 如图6所示，原代分离培养的睾丸间质细胞呈多角形、三角形或梭形，核较大，存在“拉网”现象，台盼蓝染色后细胞存活率90%以上；经3β-HSD染色的细胞质呈深蓝色，细胞纯度大于90%。
3.4.2 恩施巴戟提取物和水晶兰苷对睾丸间质细胞存活率的影响 如图7所示，不同质量浓度的恩施巴戟水提取物及50%、70%、95%乙醇提取物和水晶兰苷作用于睾丸间质细胞后，细胞存活率均大于90%，对细胞无明显的毒性作用。同时，与对照组比较，12.5～100 μg/mL恩施巴戟95%乙醇提取物及25 μmol/L水晶兰苷作用24 h后，均具有促进细胞增殖的作用（P＜0.01）。
3.4.3 恩施巴戟提取物和水晶兰苷对睾酮分泌的影响 如图8所示，与对照组比较，恩施巴戟水提取物、50%乙醇提取物对睾酮分泌无明显影响。5～10 μg/mL的恩施巴戟70%乙醇提取物、2.5～10 μg/mL 95%乙醇提取物、12.5～25 μmol/L的水晶兰苷等可促进睾酮分泌，且具有显著差异（P＜0.05、0.01）。
3.4.4 恩施巴戟提取物和水晶兰苷对睾酮合成和凋亡相关基因表达的影响 选取具有促进睾丸间质细胞增殖和睾酮分泌作用的95%乙醇提取物进行后续研究，如图9所示，与对照组比较，恩施巴戟的95%乙醇提取物（25 μg/mL）和水晶兰苷（25 μmol/L）均显著促进StAR和Cyp11a1的mRNA表达（P＜0.05、0.01），升高Bcl-2/Bax值（P＜0.01）；水晶兰苷（50 μmol/L）显著促进Cyp11a1的mRNA表达（P＜0.05），升高Bcl-2/Bax值（P＜0.01）。因而，恩施巴戟的95%乙醇提取物和水晶兰苷可促进睾酮合成相关基因（StAR和Cyp11a1）以及抗凋亡相关基因的表达。
3.4.5 恩施巴戟提取物和水晶兰苷对Star蛋白表达的影响 如图10所示，与对照组比较，恩施巴戟的95%乙醇提取物（100 μg/mL）和水晶兰苷（25 μmol/L）显著促进StAR的蛋白表达（P＜0.01）。
4 讨论
乔智胜等[21]通过文献考证和实地考察认为，唐代至清末广泛运用的巴戟天为归州巴戟天，即《湖北省中药材质量标准》收载的恩施巴戟。恩施巴戟是传统补肾壮阳药，一般认为该类药材主要通过提高血清中睾酮水平，缓解阳虚症状，从而维持正常性功能[22]。LC-MS分析显示，恩施巴戟主要含有水晶兰苷、车叶草苷酸、去乙酰基车叶草苷酸等环烯醚萜苷类成分及1-羟基-2羟甲基蒽醌等蒽醌类成分。水晶兰苷等环烯醚萜苷类成分对肾损伤有着一定治疗作用[20]，同时本研究表明水晶兰苷具有促进睾丸间质细胞生长和睾酮分泌的作用，因而水晶兰苷可能为恩施巴戟补肾壮阳作用的药效物质基础。
通过网络药理学和分子对接预测恩施巴戟治疗睾酮缺乏症的潜在靶点主要为MAPK1、EP300、PIK3R1、PIK3CA、AKT1等。MAPK1作为MAPK信号转导途径的重要组成部分，可激活MAPK/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）途径[23]；PIK3R1、PIK3CA、AKT1均属于PI3K/Akt通路上的靶点；而EP300通过与磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）特异性结合来介导cAMP基因调控[24]。由此可见，恩施巴戟的潜在靶点主要分布于cAMP、MAPK、PI3K/Akt等信号通路，与KEGG通路富集分析结果一致。cAMP信号通路[25]、p38 MAPK等的磷酸化水平[26]以及PI3K/Akt通路[27]等均可调控睾酮合成相关蛋白（StAR、HSD3B1、Cyp11a1等）和CREB磷酸化水平，从而调控睾酮合成的过程，调节睾酮水平[28]。
睾酮由胆固醇经Star、Cyp11a1等一系列蛋白酶作用下合成并分泌，雄性体内95%的睾酮由睾丸间质细胞分泌[29]。本实验采用原代分离培养的睾丸间质细胞为研究对象，cAMP促进剂Fsk具有促进睾酮分泌的作用[30]，以Fsk作为阳性对照。睾丸间质细胞实验进一步验证了网络药理学预测结果，水晶兰苷含量较高的提取物（70%和95%乙醇提取物）促进睾丸间质细胞生长和睾酮分泌的作用更显著。作用机制与其上调Bcl-2与Bax的比值，增强睾丸间质细胞的抗凋亡能力，以及促进StAR等睾酮合成相关酶的基因和蛋白表达有关。
综上所述，网络药理学和分子对接结果显示，恩施巴戟主要通过MAPK1、EP300、PIK3R1、PIK3CA、AKT1等潜在靶点和cAMP、MAPK、PI3K/Akt等信号通路发挥作用，水晶兰苷为其补肾壮阳作用的主要有效成分之一。LC-MS/MS分析和睾丸间质细胞实验结果验证了网络药理学预测分析，恩施巴戟提取物和水晶兰苷均具有促进睾丸间质细胞生长和睾酮分泌的作用，其作用机制与增强睾丸间质细胞的抗凋亡能力和促进睾酮合成相关酶的表达有关。本研究提供了恩施巴戟的药理学研究基础和新的思路，为恩施巴戟质量标准的制定和临床应用奠定了实验基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：朱成姗，李子寒，彭洪兵，尹 聪，李 娟，陈科力，肖 凌，聂 晶，刘义梅．基于网络药理学和睾丸间质细胞模型探讨恩施巴戟促进睾酮分泌的作用机制 [J]. 中草药, 2022, 53(23):7430-7439.
转自：“如沐风科研”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
