以下文章来源于Ad植物微生物 ，作者潘潘
2022年11月，国际权威学术期刊New Phytologist发表了福建农林大学许卫锋（ISME | 福建农林许卫锋团队揭示内生真菌与土壤微生物群落在水稻根鞘形成中的协同作用!）团队的最新相关研究成果，题为Soilborne bacterium Klebsiella pneumoniae promotes cluster root formation in white lupin through ethylene mediation的研究论文。
摘要
白羽扇豆排根在低磷(LP)的诱导下能有效地获得有效磷，但土壤微生物与排根形成(CRF)的关系尚不清楚。我们通过高通量测序和根-细菌相互作用研究了土壤携带的细菌在排根形成(CRF)对LP反应中的作用。
与未灭菌土壤相比，灭菌土壤中生长的植物排根数量显著减少。对土壤(整体、根际和根鞘)和根(主根、侧根和根鞘)的微生物组分析表明，CR富含变形杆菌。大规模的基因表达水平表明乙烯参与了在排根形成(CRF)中的调节作用。Klebsiella pneumoniae(P7)是从CR中分离到的一种变形杆菌。在分离到的11个菌株中，P7的1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(accd)活性最高，该酶通过裂解乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)来抑制植物体内乙烯的生物合成，并在LP条件下促进CRF。我们在P7的遗传背景中构建了一个accd缺失突变体accd。功能缺失突变在LP条件下不能促进CRF。此外，生长素反应可能参与Klebsiella pneumoniae-乙烯介导的排根形成(CRF)。
总之，我们认为土壤传播的Klebsiella pneumoniae通过乙烯促进了白羽扇豆的CRF对LP的响应。
引言
白羽扇豆(Lupinus Albus)为豆科一年生豆科植物。它形成排根(CRS)，由大量短根组成，以响应低磷水平。沿着初级侧根出现的致密根被认为遵循与侧根类似的发育模式(LRs)。在白羽扇豆中，CRS分泌大量的有机酸(如苹果酸、柠檬酸、草酸和富马酸)、磷酸酶和质子，从而使周围的根际强烈酸化；这使得植物能够有效地从土壤的有限区域获得磷。有机酸和质子的分泌强烈地酸化了周围的根际；因此，CR附近的区域构成了一个高度选择性的环境。研究发现，成熟土壤中细菌的丰度和多样性降低，变形杆菌门中的细菌比例明显较高，能够在酸性土壤中生长，这表明土壤中的微生物群落能够受到CRS的影响。根与根际微生物群落之间的相互作用对植物生长和表现至关重要。先前的研究发现，从植物根际或根内分离的许多细菌具有促进植物生长的活性。部分细菌能产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(accd)，直接将植物根系释放的乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)裂解成氨和α-酮丁酸，从而限制ACC的有效含量，降低植物根系内源乙烯水平。这反过来又制止乙烯介导的根生长抑制，从而促进LR的形成。
以前的一些研究表明，一些因素，如ATP转运蛋白37(ABCG37)、Puchi-1和蔗糖可能有助于低磷(LP)条件下白羽扇豆排根的形成(CRF)。然而，CR形成的机制尚不清楚。
白羽扇豆根动态地在不同类型的根上形成了定居的微生物分类群。然而，调节微生物集群形成的机制尚不清楚。
本研究对白羽扇豆CRF中的微生物群落及其预测功能进行了研究。对不同磷水平下的细菌群落和根部进行了序列分析，并评价了分离的细菌对排根形成的影响，目的是阐明白羽扇豆在LP条件下中细菌在排根形成(CRF)中的作用。
结果
1、白羽扇豆CRF与土壤微生物的关系
为了评估土壤微生物在LP条件下白羽扇豆排根形成中的作用，记录在未灭菌和灭菌的土壤中培养4wk的植株的CR。我们假设在灭菌土壤中生长的植物的CR数小于在未灭菌土壤中生长的植物的CR数。
图1a, b: NP土壤的Olsen P和全P显著高于LP土壤，土壤灭菌对NP和LP土壤的P水平几乎没有影响，表明土壤中的微生物可能是那些生长在未灭菌或灭菌土壤中的植物CR数量变化的主要因素。
图1c: 同时，通过灭菌消除土壤微生物也对植物吸收磷产生了负面影响，与那些生长在天然未灭菌土壤中的植物相比，根的总磷浓度下降是明显的，这表明微生物对植物生长的重要性。
图1d: 与生长在LP灭菌土壤中的植株相比，生长在LP灭菌土壤中的植株的CR值显著降低了27%，这表明土壤中的微生物是改变白羽扇豆对LP反应的CRF的关键因素。
图1:在低磷(LP)条件下土壤微生物参与白羽扇豆排根的形成
2、在低磷条件下白羽扇豆根富含变形杆菌门的细菌，可能与排根形成(CRF)有关
为了确定能够调节CRF对外部LP的响应的微生物类型，我们用16S rRNA及其测序方法分析了土壤和植物中的细菌和真菌微生物群(图S1a)。与土壤相比，植物组织中细菌群落多样性显著降低(图S1B)，而真菌群落多样性在样本之间没有显著差异(图S1C)。PCoA表明，无论土壤磷水平如何，植物组织中的细菌群落组成都发生了强烈的变化，包括根(图S1D)。
图2a: 在LP条件下，在>0.1%丰度的细菌门中，变形菌门和厚壁菌门是土壤和植物组织中最丰富的门；前者在植物根内和叶片中高度丰富。
图2b, c: 与土体土、根际和根鞘相比，白羽扇豆的细菌多样性下降。而真菌多样性保持相对稳定。
图2d, e: 细菌的相对丰度也表明变形杆菌的丰富。
在NP条件下，观察到细菌和真菌的丰富以及多样性的平行趋势(图S2)。变形杆菌在包括CRS在内的植物组织中的强烈富集性突显了这一门对白羽扇豆对LP反应的CRF的重要性。
图2:根际富含土壤变形杆菌可能与白羽扇豆排根形成有关
3、变形杆菌P7通过乙烯介导促进CRF
为了确定变形杆菌中的哪一种细菌可以在LP条件下调节白羽扇豆的CRF以及这种调节是如何发生的，从CRS内层分离和纯化细菌。RNASeq数据我们发现，与NP相比，LP条件下的LRFZ中乙烯激活的信号通路显著丰富，表明乙烯在CRF中的重要性。
图3a: 为此，检测了11个分离菌株的accd活性，其中来自变形杆菌的Klebsiella pneumoniae(P7)的accd活性最高，这表明P7通过accd酶裂解乙烯前体的能力最强，从而阻止了根中乙烯的生物合成。
图3b, c: 为了测试细菌P7介导的乙烯变化是否可以改变CRF，构建了Klebsiella pneumoniae遗传背景中的accd敲除突变体(accd)，与P7相比，该突变体的accd活性损失了70%。
图3d: 与未接种的对照相比，接种P7的白羽扇豆后LRFZ的ACC浓度降低了28%，而accd缺失突变体与CK处理相比未能改变该区域的ACC水平。
图3e，f: 接种P7的植株在LP(+75%)下发育出更多的CRS。相反，接种突变体accd对CR数没有影响。
图3g: 注意到P7和accd的加入几乎不改变土壤中的Olsen P，表明P7介导的乙烯抑制可能改变了CRF。
为了进一步证实这一发现，使用了乙烯前体ACC和乙烯生物合成抑制剂PZA。
图3h: 与水培对照相比，外源添加ACC强烈地限制了CRF的数量，而PZA显著增加了CRS的数量；P7和accd分别接种ACC和PZA的植株逆转了对CRF的细菌效应。
结果证实，在LP条件下，P7通过乙烯介导促进CRF。
图3:变形杆菌P7通过乙烯介导促进排根形成
4、生长素反应可能参与Klebsiella pneumoniae介导的排根形成(CRF)
为了加深对P7促进CRF的机制的理解，根据不同发育特征将它们分成PE和LRFZ(图4a)，并定量分析了不同根区在基因组水平上的基因表达水平。外源磷强烈影响根的总基因表达水平(图4b)。
图4c: 不同处理下根中差异表达基因热图。
图4d: 在P7侵染的LRFZ中，DEGS的平均表达水平显著高于accd，其中乙烯激活信号通路和生长素激活信号通路的GO项或与植物激素信号转导有关的KEGG项明显丰富(S9、S10；表S17)，表明生长素和乙烯在LP下CRF中的重要性。
图4e: 与未接种对照相比，P7显著抑制了LRFZ中PIN3和PIN7的基因表达，而accd缺失突变体accd对这两个基因的表达水平几乎没有影响。同时抑制导致LRFZ中生长素的积累，从而进一步促进了LP条件下白羽扇豆中的CRF。
图4f: 在P7抑制PIN3和PIN7的同时，LRFZ中的IAA高度积累，突变体accd未能启动IAA的积累。
为了探讨白羽扇豆中生长素与CRF的关系，在LP栽培条件下对羽扇豆苗进行了IAA和生长素运输抑制剂NPA的处理。IAA的添加对接种P7或accd的植株的CR数有正向影响。
图4G: 然而，无论是否接种细菌，NPA的应用都显著降低了植物的CRF，这表明在P7介导的白羽扇豆CRF中生长素是必要的。
综上所述，这些结果表明，P7介导的乙烯抑制导致了LRFZ中生长素的积累，从而进一步导致了LP条件下白羽扇豆中对CRF的促进。
图4: P7在低磷条件下通过触发乙烯介导的生长素在侧根形成区(LRFZ)的外流促进排根形成(CRF)
讨论
土壤变形杆菌在低磷条件下对白羽扇豆CRF的重要作用
了解排根形成对白羽扇豆LP的反应是通过基因工程改良作物和管理可持续农业中P投入的先决条件。与根际微生物群落之间的相互作用对植物生长和表现至关重要。白色羽扇豆根动态地塑造了在各种类型的根中定居的微生物分类群。然而，微生物调节CRF的机制仍不清楚。我们在未灭菌或灭菌土壤上移栽羽扇豆属植物的实验表明，根际微生物群的消除对LP下的CRF产生了负面影响(图1)，强调了土壤微生物参与了白羽扇豆对LP的CRF反应。在白羽扇豆中，CR可以分泌有机酸、质子和磷酸酶。由于碳有效性和pH的快速变化，CR的根际构成了一个高度选择性的环境。通过16S rRNA测序，分析了土壤(土壤、根际和根鞘)和植物不同组织中的细菌和真菌群落。结果表明，变形菌门被植物组织强烈丰富，包括CRS(图2)，这一结果与先前对CRS直接附近的细菌群落的调查一致。栖息在白羽扇豆根部的优势细菌门变形杆菌暗示了它与排根形成(CRF)的潜在联系。
Klebsiella pneumoniae(P7)通过乙烯介导促进CRF
先前通过转录因子基因表达和乙烯前体添加的研究表明乙烯对于CR原基的诱导是必要的。因此我们对从CRS内分离的11株菌株进行了accd的检测。属于变形杆菌的Klebsiella pneumoniae(P7)的accd酶活性最高。构建了accd缺失突变体accd。与LP处理的对照相比，接种P7抑制了LRFZ中ACC的积累。更低的ACC水平可能会对CRF产生积极的影响，这从CR数的增加可见一斑。相比之下，突变体accd在ACC和CRF上都失去了作用。为了证实乙烯在LP条件下CRF中的作用，使用了乙烯前体ACC和乙烯生物合成抑制剂PZA。与水培对照相比，外源ACC的使用强烈地限制了CR的数量，而PZA处理则显著增加了CRF的数量，说明乙烯对CRF的负面影响。在我们的研究中，在接种P7的植物中添加ACC高度限制了这种土壤细菌对CRF的促进作用。在接种accd的植株中加入PZA也有类似的效果。之前的研究发现，一些细菌可以吸收植物根部释放的ACC，并将其转化为氨和乙酸乙酯。因此，ACC的短缺导致根中内源乙烯的减少，从而进一步防止乙烯介导的根生长抑制。综上所述，结果表明，在LP条件下，P7通过乙烯介导促进CRF(图5)。
图5: 克雷伯氏菌在低磷(LP)条件下促进白羽扇豆丛根形成的模型
Klebsiella pneumoniae-乙烯介入性排根形成(CRF)中生长素反应的参与
在LP条件下，白羽扇豆根形成密集簇生的排根，即所谓的CR。沿着初级LR出现的确定根被认为遵循与正常LR相似的初始发育模式。在我们的研究中，突变体accd导致了比野生型P7菌株在LP下接种更多的ACC在根中的积累(图3D)。通过比较P7接种LRFZ和突变体accd接种LRFZ的大规模基因表达，我们发现accd下调了白羽扇豆LRFZ中乙烯不敏感2的表达(图4C)。乙烯不敏感2被认为是乙烯信号转导的中心成分，并受乙烯积累的正向调节。同时，接种accd还导致了生长素外排载体PIN3和PIN7在白羽扇豆LRFZ中的表达上调(图4，S11)。这两个载体负责从原生木质部的中柱轮处输出生长素，其中LR是由生长素的积累启动的。此外，我们先前的研究发现ABCG37通过改变生长素稳态来正向调节CRF，在P7接种的LRFZ中高表达，但在接合的植物中不表达。生长素在乙烯介导的CRF中的作用是明显的，通过外源添加IAA和生长素运输抑制剂NPA(图4G)。这些发现表明，P7-乙烯介导的CRF也可能需要生长素反应。
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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