斯坦福大学亓磊团队发表CRISPR疗法进展的综述

RNA引导的原核CRISPR相关(Cas)蛋白可以在哺乳动物基因组中产生靶向双链断裂，这一发现催化了聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)的复兴。这一发现导致了CRISPR系统的发展，该系统利用天然DNA修复机制，比以往任何时候都更容易、更精确地修复缺陷基因。

近日，斯坦福大学亓磊团队综述了近年来CRISPR疗法的进展。在临床前研究和一些临床试验中，CRISPR已被用于敲除有害的突变基因，并修复编码序列中的错误，以挽救疾病表型。然而，大多数遗传疾病是由基因组编码和非编码区域的突变、缺失和复制的组合造成的，因此需要复杂的基因组工程策略，而不是简单的基因敲除。相关研究于近日发表在《Nature Reviews Nephrology》（IF=42）上。

为了克服这一限制，天然的工程CRISPR-Cas系统工具箱已经显著扩大，包括在人类细胞中发挥作用的各种工具，用于精确的基因组编辑和表观基因组工程。应用CRISPR技术编辑非编码基因组、调节基因调控、进行精确的基因改变和针对传染病，有可能为许多以前无法治疗的疾病带来治愈疗法。

另外，2022年8月11日，斯坦福大学亓磊（Lei Stanley Qi）团队在Science 在线发表题为“Nested epistasis enhancer networks for robust genome regulation”的研究论文，该研究将多重 CRISPRi 筛选与机器学习相结合，以定义定量增强子-增强子的相互作用。该研究发现超长距离增强子网络具有嵌套的多层结构，赋予基因表达的功能稳健性。实验表征表明，增强子上位性是通过三维染色体相互作用和 BRD4 凝聚来维持的。协同增强子的机器学习预测提供了一种有效的策略来识别与全基因组关联研究 (GWAS) 分析之外的疾病中的致病基因相关的非编码变异对。总之，该研究工作揭示了嵌套的上位性增强子网络，它可以更好地解释细胞内和疾病中的增强子功能。

在细菌基因组测序的早期，当时研究人员注意到“一种不寻常的结构”，它包含大肠杆菌染色体中的短而重复的DNA序列。随后的研究在其他原核细胞中发现了更多这样的结构基序。2005年，对这些重复序列之间的序列(称为聚类规则间隔短回文重复序列)进行了分析，发现它们与噬菌体基因组完全匹配。进一步分析这些重复间隔位点的上游和下游区域，发现一组编码基因经常在CRISPR阵列上共定位。这些编码基因被命名为CRISPR- associated (Cas)蛋白。2007年的一项研究报告称，表达Cas蛋白的酸奶发酵菌(嗜热链球菌)和含有与噬菌体基因组匹配的间隔子的CRISPR阵列可以保护噬菌体不受感染。

值得注意的是，在某些细菌中，CRISPR相关蛋白9 (Cas9)被确定为单独负责RNA介导的DNA切割。这种CRISPR介导的噬菌体保护机制是通过详细的生化工作来描述的。CRISPR阵列被转录为单个RNA，然后在重复处加工成更短的CRISPR RNA (crRNAs)，每个crRNAs包含一个单独的间隔。crRNA与一个小的反式激活的CRISPR RNA (tracrRNA)杂交，然后可以被Cas9识别和结合，创造一个核糖核蛋白(RNP)复合体。RNP复合体与噬菌体基因组结合，寻找与crRNA上编码的间隔序列匹配的序列。一旦同源性被发现，Cas9充当核酸酶，通过切割DNA产生双链断裂(DSB)，从而抑制噬菌体的生命周期。

图自：Nature Reviews Nephrology

CRISPR–Cas9系统这种简单的机制立即被认为是编辑DNA和治疗疾病的有前途的工具。为了简化CRISPR-Cas9并使其更易于基因编辑，crRNA和tracrRNA被融合成一个单一的小向导RNA(sgRNA)，从而创建一个双组分系统：Cas9蛋白生成DSB， sgRNA引导核酸酶到达用户定义的基因组位点。在哺乳动物细胞中，该系统首次用于利用天然DNA修复机制，通过更有效的非同源末端连接(NHEJ)和更低效的同源定向修复(HDR)过程进行基因编辑。

NHEJ导致易出错的indel(插入和删除)形成，而HDR由于其精确的编辑方式通常是更理想的治疗结果。修复CRISPR诱导的DSBs的NHEJ途径的主要存在，导致大多数早期的努力集中在敲除单基因孟德尔病中的有害突变基因。然而，许多疾病不能通过简单的基因敲除来治疗，需要更细致的基因组工程。在这篇综述中，专注于CRISPR在潜在治疗无法通过诱导编码基因的框架转换或过早停止来克服的疾病方面的应用。

该综述概述了Cas蛋白工程和Cas9以外的CRISPR系统，这些系统创造了一个人类基因组工程的工具箱。然后，该综述又详细介绍了如何利用这些工具为尚未被其他形式的药物治愈的疾病创造新的疗法。

来源：iNature

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41581-022-00636-2

转自：“威斯腾生命科学研究院”微信公众号

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