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镜中花，水中月都属于镜像中的世界，碰不到，捞不着。那么什么是镜像生命呢？这就涉及到手性的概念。简单地说，就是让有机大分子照镜子，镜外的是正常分子，镜内的就是镜像分子。在化学中，有机大分子一般都有两种手性，即L构型和D构型。有趣的是，生物大分子保持了惊人的一致，组成DNA/RNA的核苷酸都是D手性的，而组成蛋白氨基酸都是L手性的。自然界几乎不使用这些分子的镜像版本，也就是D-氨基酸和L-核酸1。西湖大学朱听教授希望通过创造镜像DNA以及能够复制、转录和翻译这种非天然DNA的酶系统来填补这个空白。
其次，这项工作也有实际应用价值。举个例子，因为人体的分子机器不能识别这些镜像分子，所以镜像DNA、RNA和酶分子能抵抗天然酶系统的降解，很大程度上避免触发免疫反应，这一特性使得镜像分子可能成为有用的药物。一小段镜像DNA或镜像RNA可以折叠成三维结构并与特定的生化靶点结合，目前已有研究将镜像核酸适配体或镜像多肽开发为治疗疾病的手段。而且这一研究也有助于科学家理解生命的起源。
至今，西湖大学朱听课题组已初步实现了镜像中心法则中的镜像核酸复制、转录、反转录等过程，突破了大型镜像蛋白质全化学合成和千碱基长度镜像基因合成的技术瓶颈，开发了镜像核酸测序、镜像DNA信息存储、镜像核酸定向进化等技术，目前正在着力构建镜像蛋白质翻译系统以实现完整的镜像中心法则，并尝试拓展镜像生物学系统的实际应用。
镜像生物学合成中最困难的步骤是将镜像RNA翻译为镜像蛋白。在自然界中，翻译是由核糖体完成的，核糖体是一种由多种蛋白质和RNA组成的巨大的复合物， 核糖体RNA是核糖体的结构与催化核心，其分子量约占核糖体总分子量的2/3，因此，合成镜像核糖体的难点在于制备长度分别约为120 nt、1.5 kb及2.9 kb的镜像5S、16S及23S核糖体RNA。然而受限于已有的技术，此前能获取的最长镜像RNA仅有120 nt，远不足以实现制备长链镜像RNA的目标。
2022年10月27日，西湖大学朱听实验室在Science期刊上发表了题为Mirror-image T7 transcription of chirally inverted ribosomal and functional RNAs的论文。研究者使用化学方法合成了一个100KDa的镜像T7 RNA聚合酶，该酶能够高效、高保真地转录全长镜像基因5S、16S和23S核糖体RNA。此外，研究者进一步开发了多功能镜像T7转录系统的实际应用，如镜像核糖开关 (riboswitch)、镜像核酶 (ribozyme) 等，以作为基础RNA研究的模型系统。
分割蛋白质 (split-protein) 设计可以将一个大的（自然手性或镜像）蛋白质分割成两个或多个小的蛋白质分割片段，这些片段可以在体外共同折叠成功能完整的酶2。研究者设计了一个T7 RNA聚合酶的二分割策略，使用了先前报道的N601和T602之间的分裂位点3和新发现的K363和P364之间的分裂位点，将T7 RNA聚合酶分为三个分裂蛋白片段：363个氨基酸的N片段、238个氨基酸的M片段和282个氨基酸的C片段（图1B）。然后研究者对自然手性和镜像T7 RNA聚合酶的二分割突变体进行了全化学合成，最终得到了具有完整功能的100 kDa高保真镜像T7 RNA聚合酶（图1C）。
图 1 合成的自然手性和镜像T7 RNA聚合酶
接下来，研究者进一步评估镜像T7 RNA聚合酶的转录活性。实验发现，镜像T7 RNA聚合酶能够转录全长122 nt的镜像5S rRNA（图2A），尽管其效率较低。并且由于镜像5S rRNA对自然手性核糖核酸酶A (RNase A) 消化具有抗性（图2B）。因此研究者通过检验合成的自然手性T7 RNA聚合酶的转录保真度来估计镜像聚合酶的转录保真度，错误率为10-4量级。
图 2 短L- RNA的镜像T7转录
在成功实现短L-RNA的转录后，研究者尝试对千碱基长镜像rRNA进行转录。经过一系列优化后，研究者用合成的镜像T7 RNA聚合酶成功转录了全长1.5 kb 16S和2.9 kb 23S rRNA，并通过低熔点琼脂糖凝胶电泳和β-琼脂酶I消化法从双链L-DNA模板中纯化了镜像16S和23S rRNA（图3A、B）。此外，相较于自然手性rRNA，镜像5S、16S和23S rRNA更稳定，不易被RNase降解（图3C）。同样，研究者也评估了长碱基RNA下镜像T7 RNA聚合酶的转录保真度，错误率同样在10-4量级。
图 3 长千碱基镜像rRNA的镜像T7转录和纯化
基于镜像T7 RNA聚合酶的成功开发，研究者将镜像鸟嘌呤适配体与镜像Spinach 适配体融合，开发了130nt的镜像核糖开关传感器，探索镜像T7转录系统的实际应用（图4A）。因为鸟嘌呤和DFHBI（Spinach 适配体的小分子荧光团）都是非手性的，因此自然手性和镜像核糖开关传感器有望表现出相同的结合特性。研究发现，当与相同浓度的鸟嘌呤孵育时，自然手性和镜像核糖开关传感器表现出几乎相同的荧光强度，而在相同浓度下，自然手性和镜像核糖开关传感器与D型或L型鸟嘌呤三磷酸 (GTP) 和腺嘌呤之间没有检测到明显的结合（图4C）。此外，与不含或含RNase抑制剂的自然手性核糖开关传感器相比，镜像核开关传感器显示出更长的半衰期（图4D）。研究者将这二者稳定性上的差异归于自然手性核糖开关对环境中的RNase非常敏感，而镜像核糖开关则具有抗性。
图 4 镜像核糖开关传感器
然后研究者测试了无保护的千碱基长L-RNA在各种环境中的稳定性。将纯化后的长度为1.5 kb的天然及镜像16S rRNA储存在经DEPC处理去除核糖核酸酶（RNase）的超纯水中，天然RNA在4小时后被完全降解；即使在样品中添加RNase抑制剂，48小时后也被完全降解；而镜像RNA在30天后才被完全降解（图5A-C）。研究者进一步将自然手性和镜像16S rRNA在池塘水中孵育，无论是否使用RNase抑制剂，自然手性16S rRNA均在4小时后完全降解，而镜像则在7天后观察到完全降解（图5D-F）。鉴于镜像RNA具有独特的生物稳定性，未来有望成为一种不受RNase污染影响的RNA研究模式系统。
图 5 长千碱基L-RNA的稳定性
生物稳定的L-RNA模型系统可能有助于核酶的体外研究，特别是对生命起源的研究。接下来研究者用合成的镜像T7 RNA聚合酶和镜像PCR组装的双链L-DNA模板转录了镜像“38-6”聚合酶核酶和单链L-RNA模板（图6A）。与D-核酶相比，L-核酶的延伸效率几乎相同（图6D），说明了镜像T7转录L-RNA的高质量。此外，研究者同样评估了自然手性和镜像“38-6”聚合酶核酶、RNA模板和RNA引物的稳定性，发现在2mm Mg2+浓度下，L-核酶的半衰期比自然手性版本的半衰期更长（图6E）。
图 6 L-核糖酶催化的L-RNA聚合
总的来说，本项研究新合成了一个镜像T7 RNA聚合酶，并利用该镜像聚合酶转录并纯化了长度达2.9 kb的rRNA，为目前已报道的最长镜像RNA。镜像T7转录的实现使高质量长L-RNA在诊断和治疗、信息存储和基础RNA研究方面的各种实际应用成为可能。此外，高效镜像DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和测序工具的集成将进一步促使镜像方案的实现，用于靶向生物学重要分子的L-RNA适体的定向进化和选择，可以作为潜在的临床和研究工具。
原文链接
https://www.science.org/doi/10.1126
/science.abm0646
转自：“北京生物结构前沿研究中心”微信公众号
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