经Horticulture Research 编委会专家评审，东北师范大学分子表观遗传学重点实验室和吉林农业大学园艺学院合作的题为The biochemical and molecular investigation of flower color and scent sheds lights on further genetic modification of ornamental traits in Clivia miniata的研究论文当选Horticulture Research 2022年9月封面文章。
该研究以“大花君子兰”为实验材料，鉴定了花器官中积累和释放的植物色素和挥发性有机小分子，并围绕花色苷、类胡萝卜素和挥发性萜类物质的合成和调控，探究了大花君子兰观赏性状不丰富的机制，并针对遗传缺陷提出了可能的大花君子兰花香、花色改良的分子设计方案。
该研究首先测定了大花君子兰花朵发育不同时期以及不同组织或器官中的花色苷含量和种类，发现花朵中主要积累天竺葵素衍生物以及很少量的矢车菊素衍生物；大花君子兰幼叶红色的基部主要积累矢车菊素衍生物以及少量的天竺葵素衍生物；而红色的果皮中天竺葵色素衍生物和矢车菊素衍生物含量接近1:1。在大花君子兰中未检测到飞燕草素衍生物的存在（图1）。大花君子兰花中花色苷种类的缺乏是导致其花色单一的主要因素。
图1 大花君子兰花朵发育不同时期及不同组织中花色苷的积累
随后，研究团队发现大花君子兰中缺少控制飞燕草色素衍生物合成的关键基因F3'5'H，这可能是导致飞燕草色素衍生物合成受阻的关键原因。表达模式分析发现，大多数花色苷合成相关的基因在花朵中的表达模式与花色苷的积累模式相似，但F3'H基因主要在大花君子兰幼叶红色的基部和红色果皮中表达，在花朵中的表达量随着花朵发育呈现出逐渐降低的趋势，暗示F3'H基因在花中的低表达致使花朵中矢车菊色素衍生物含量较低。花色苷的合成受到MYB-bHLH-WD40复合物的严格调控，针对转录因子的表达模式分析发现，三条可能激活花色苷合成的MYB转录因子在大花君子兰花朵、幼叶基部和果皮中的表达呈现明显的特异性，暗示MYB转录因子可能决定了F3'H的差异表达。此外，F3H，DFR等处于类黄酮合成通路的节点位置，它们的酶活特性也可能影响了不同花色苷在大花君子兰不同组织或器官中的合成（图2-3）。
图2-3 类黄酮相关基因在大花君子兰花朵发育不同时期及不同组织中的表达模式
为了解析大花君子兰花朵中花色苷的合成机制，研究团队克隆了花色苷合成关键结构基因F3H和DFR，通过转基因和体外酶活等实验发现，F3H和DFR分别具有黄烷酮-3-羟化酶和黄酮醇-4-还原酶的功能，而且没有明显的底物特异性。研究团队进一步对筛选出的转录因子进行克隆和功能鉴定，证明三条MYB转录因子具有明显的转录激活活性，且能够与bHLH转录因子TT8互作，激活花色苷合成相关基因的表达，进而促进植物中花色苷的积累。有趣的是，三条MYB转录因子虽在君子兰中具有明显的表达特异性，但是它们的靶基因并没有明显的差异。此外，无论三条MYB单独还是与bHLH转录因子共同转染原生质体，都不能激活君子兰F3'H基因，暗示存在特殊的转录因子负责了君子兰F3'H基因的表达（图4）。因此，大花君子兰中F3'5'H基因的缺失，以及F3'H基因在花朵中低表达，是限制其花朵中花色苷种类和含量的重要原因。
图4 大花君子兰中花色苷合成相关基因的功能验证
为了揭示大花君子兰花朵香味近无的原因，研究团队利用气相质谱联用技术（GC-MS）测定了大花君子兰花朵发育不同时期挥发性物质的种类及含量，发现对花香具有重要贡献的挥发性萜类物质的含量很低且主要为柠檬烯。研究团队从大花君子兰转录组数据库中只挖掘到4条TPS基因，分别属于TPS-a、TPS-b和TPS-g亚家族，亚细胞定位分析表明TPS1、TPS3和TPS4定位在细胞质，而TPS2定位在质体中。植物转基因以及体外酶活等实验证明，在这4条TPS基因中，主要发挥作用的为TPS2基因（图5）。因此，多功能TPS的缺失可能是影响大花君子兰花朵香味的重要因素。
图5 大花君子兰中挥发性萜类合成相关TPSs基因的功能验证
由于花色苷和挥发性萜类物质的合成途径相对独立，所以通过改变单个基因很难同时影响花的颜色和气味。而CCDs基因能够裂解黄色的类胡萝卜素产生挥发性强且气味阈值低的脱辅基类胡萝卜素。因此，CCDs基因是同时影响植物花色和花香性状的靶点。研究团队发现，大花君子兰花朵中含有丰富的类胡萝卜素且主要为叶黄素，它与花色苷一起影响了花朵颜色。研究团队克隆得到CCD1a，CCD1b和CCD4三条类胡萝卜素裂解双加氧酶基因并利用工程菌对其进行了功能鉴定。研究发现，细胞质定位的CCD1a和CCD1b能够分别裂解番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质，生成甲基庚烯酮和β-紫罗兰酮，而未检测到定位于质体的CCD4的功能（图6）。考虑到植物细胞中类胡萝卜素主要存在于质体中，CCD1a和CCD1b的细胞质定位可能影响了它们对底物的利用，这可能也是大花君子兰花朵呈现较强的黄色背景，且香味近无的原因之一。
图6 大花君子兰中CmCCDs基因和类胡萝卜素合成基因的功能验证
基于上述研究结果，研究团队总结了大花君子兰花朵中主要花色和花香物质合成模式图并提出了可能的改良建议（图7）。在大花君子兰中转入F3'5'H基因或提高F3'H基因表达量，引入其他植物中多功能TPS基因，改变CCD1的亚细胞定位或转入质体定位的多功能CCD1或CCD4基因等，是大花君子兰花色和花香改良的重要策略和方向。
图7 大花君子兰细胞中主要花色和花香物质合成模式图
综上，该研究系统探究了影响大花君子兰花朵颜色相对单一，花香近无的原因，为进一步分子设计改良君子兰的花色和花香性状奠定基础，同时为相关植物种质创新工作的开展提供了思路。
东北师范大学分子表观遗传学教育部重点实验室高翔教授和王丽教授以及吉林农业大学园艺学院赵春莉副教授为该论文的通讯作者。东北师范大学分子表观遗传学教育部重点实验室青年教师李月庆老师和已毕业的博士研究生高瑞芳（目前为吉林大学鼎新学者）为论文的共同第一作者。本研究得到了国家自然科学基因项目（31900252、31972445）和吉林省科技厅项目（20210101005JC、20190201299JC）的资助。
文章链接：
https://doi.org/10.1093/hr/uhac114
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