摘 要
当前医学研究领域新理念、新技术、新方法不断涌现，突破了固有思维形态和研究模式，正在催生中医药研究范式的转变。
该文以丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛临床研究为例，以“肯定疗效，规范标准，发现机理”的科学理念为纲领，以研究的立题背景、指标评价模式、试验设计方法、安慰剂盲法实施、数据管理制度、模块药理学框架下中药复方临床药效机制探索等为主线，对中药上市后品种有效性再评价的研究模式进行了探讨。
该研究首次绘制了丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的以靶向功能模块构成的靶点网络，并将循证研究与模块药理学框架相结合，最终将药理机制变化与临床疗效变化相关联，探究了疗效表型相关性优势，旨在为中药上市后疗效评价提供一个可参考的模板，为多靶点中药复方多表型药理机制研究及精准治疗提供新的思路，促进中医药的创新性发展。
关键词：中医药临床研究；中药复方药理机制；适应性设计；模块药理学；丹红注射液
近年来，中医药发展迎来了天时、地利、人和的大好时机。2019 年 5 月，第 72 届世界卫生大会审议通过了《国际疾病分类第十一次修订本（ICD-11）》，首次纳入外感病、脏腑证等中医病证名称，成为国际疾病“通用语言”，堪称中医走向世界的里程碑，也是中医药在国际得到越来越多认可的明证。
同时，一批发表在顶级医学期刊的高质量中医药研究领域随机对照试验（RCT）证据，如麻杏石甘汤与银翘散加减方治疗甲型 H1N1 流感[1]、芪苈强心胶囊治疗慢性心衰[2]、针灸治疗女性压力性尿失禁等[3]，不断证实了中医药的疗效优势，产生了广泛的国际学术影响。
然而，在走向国际化的征途中，一些上市后中药品种由于原研时期条件所限、相关法规及审评制度等特殊历史原因，使得有效性和安全性评价的内容不充分、不完备，成为制约其进一步发展的瓶颈。
中医药的发展需要实事求是，在尊重传统医学理论的基础上，将中医理论精华与现代医学评价方法相结合，既汲取中医药丰富的养料，深入挖掘其价值，又要善于利用现代医学的技术和成果。
近年来，王永炎院士提出了“肯定疗效，规范标准，发现机理”的中医药科研范式及理念[4]。面对现代医学科研的通用语言，积极拥抱循证医学，把疗效讲清楚，把机理说明白，用公认的标准证明自己，是摆在中医人面前的重要任务。
中药的疗效与治疗机制，相当一部分是可以用现代科学解释，以临床评价的成果为线索，结合多组学数据，深入研究其效应机制，搞清楚其所以然，再将机制研究的成果反馈临床，推广应用到临床实践中去，是充分利用现代科技为传统赋能的创新性探索。
本文将以丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的临床研究为例（NCT01681316）[5-6](图 1)，通过对该研究从立题设计到结局报道的详细阐释，解读“肯定疗效，规范标准，发现机理”的科学理念，旨在为中药上市后疗效评价及精准用药机制研究提供一个可参考的模板，为优化中药复方多表型药理机制研究及精准治疗提供新的思路。
一、基于临床需求的丹红注射液上市后评价研究背景
我国心血管病负担沉重，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，且患病率仍处于逐年上升的阶段[7]。如何通过有效的干预手段，降低其发病率与病死率，已成为日益迫切的重大公共卫生问题。
我国中成药治疗冠心病临床应用广泛，一些品种在缓解心绞痛、干预经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄、提高生活质量、降低心血管事件等方面具有一定的优势[8-9]。
丹红注射液由丹参和红花 2 味中药制备而成，为国家医保乙类品种。方中丹参味苦，性微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀，凉血消痈之功。其善治血分，去滞生新，调经顺脉为君；红花味辛、性温，归心、肝经，《药品化义》言其“善通利经脉，为血中气药”，具有活血通经，祛瘀止痛之效为臣[10]。两药合用共奏活血化瘀，通经舒络之功效，用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，症见胸痛、胸闷、心悸、口眼歪斜、言语蹇涩、肢体麻木、活动不利等；临床用于治疗瘀血内阻所致的各类缺血性心脑血管疾病。其上市已应用十余年，积累了一定的有效性和安全性研究数据及应用经验[11-12]，但针对不同的适应证，仍缺乏大样本、高质量的循证证据支持。
课题组依托国家“十二五”重大新药创制专项“大品种药物Ⅳ期临床试验及新药临床试验审评研究技术平台”（2011ZX09304--07），在前期详细调研、专家论证、系统总结的基础上，针对亟须解决的临床需求，按照国际通用和认可的方法与标准，开展了丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的大样本RCT[13]，旨在提供高质量的循证证据及阐释其效应机制。
该研究从方案设计之初疗效指标的选取、研究方法的确定，再到研究实施过程的管理策划及数据规范化收集，针对中药注射剂临床评价这个关键技术难题，保证项目的顺利开展。
二、肯定疗效，规范标准，搭建规范化循证临床研究平台
2.1 “以患者为中心的个体化医疗”临床研究模式
既往临床研究领域，评价临床疗效和疾病预后多考虑病死率、治愈率这些“硬”指标。然而，真实世界的临床实践中，治疗的结局除死亡和治愈外，更多的是带病存活。以病死率、治愈率作为研究终点则不能评价这种带病存活状态及其他治疗效益。因此，提高患者生存质量（quality of life，QOL）成为医疗中一个重要目的[14]。
近年来，整个医疗卫生行业都在向“以患者为中心”的价值体系转变，政府监管部门、医院、医药企业等利益相关方都迫切需要听到更多的患者声音，以更好地满足患者需求[15-16]。随着对患者报告结局（PRO）的关注增加，将 PRO 作为主要或次要终点之一的临床研究逐渐增多，在一些高质量的随机临床试验中，PRO 甚至代替了传统结局[17]。
目前，稳定性冠心病（stable coronary artery disease，SCAD）约一半的患者临床表现为心绞痛，其症状程度严重影响患者的生活质量，影响其预后(心绞痛的存在使冠心病患者发生重大心血管事件的风险增加 1 倍)[18-19]，同时，有心绞痛症状患者并发症的发病率较无症状者显著升高，使其干预更具挑战性。因此，对慢性稳定型心绞痛症状的改善策略仍是重中之重[20]。
中医药理论重整体。善用“坚盾”，更关注“病的人”，即以“患者为中心的诊疗模式”[21]，在临床实践过程中一定会考虑患者的具体情况。SCAD 的药物治疗目标是缓解心绞痛症状和预防心血管事件。
对于大多数患者，治疗目标应该是完全的，或几乎完全地消除心绞痛症状[22]。丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛临床研究在疗效指标的选取上，关注“病的人”，围绕全面反映慢性稳定性冠心病患者心绞痛状态及生存质量的相关指标进行了多维度的评价，包括西雅图心绞痛量表（SAQ）、每周心绞痛的发作次数、心绞痛分级变化、血瘀证证候的疗效等。
研究结果显示[5]，在标准化治疗基础上，使用 14 d 丹红注射液，从第 30 天开始，即可显著缓解心绞痛发作，全面且显著提高患者心绞痛质量相关西雅图心绞痛量表每个维度的评分，该效应可维持到第 90 天，心绞痛消失人数比例显著高于安慰剂对照组，从第 7 天开始可显著改善患者的血瘀证情况，该效应一直可持续至第 90 天，亦可显著改善心绞痛平均发作密度，减少硝酸甘油的累积使用量，说明丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛确有疗效。
2020 年 6 月，美国食品药品监督管理局（FDA）提出以患者为中心的药物开发（PFDD）思路[23]，即将患者的观点纳入药品监管流程以助于解决患者未满足的需求。这与丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛临床研究的初始目标不谋而合。以患者为中心的药物开发意味着需制定使患者利益最大化的研究方案，并充分尊重和体现患者的意愿。关注“病的人”，而不是只强调“人的病”，丹红注射液以患者为中心的个体化医疗临床研究模式为中医药疗效评价提供全新思路及模式。
2.2 探索提高研究质量和效率的临床试验方法
现代临床试验方法机遇与挑战并存。传统的临床研究需要在研究实施前科学设计关键参数，而研究的成功与否很大程度上取决于预先假设的准确性。近二三十年，适应性设计成为临床研究的热点。
与传统临床试验设计相比，适应性设计具有更大的灵活性，可通过早期停止试验、调整样本量、调整随机方案等方法来提高试验效率，从而最大化受试者的利益，也更加符合临床试验伦理要求[24-25]。
2021 年 1 月国家药品监督管理局药品审评中心发布《药物临床试验适应性设计指导原则（试行）》[26]，标志着我国临床试验将步入适应性设计的新时代。
为突破传统的临床研究在试验设计上的困境，针对中药临床试验的特点和国际临床研究的发展趋势，课题组前期对适应性方法及创新性临床试验设计进行了系列理论探索及开展了相关临床研究，积累了丰富的经验[27-28]。丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛临床研究自 2011 年方案设计之初即采用适应性设计，其适应性体现在 2 个方面。
①样本量重估算：该研究初始样本量为 870 例，计划在完成治疗评估人数达到总样本量的 1/3（约 288 例）及 2/3（约 582 例）时进行期中分析。
第 1 次期中分析（入组 288 例患者中 275 例完成主要疗效指标的评估）经临床数据监查工作委员会(DMC)独立支持小组统计专家分析，2 组差异无统计学意义，且 EAST 5.2 计算条件功率（CP）为 0.984，因此决定暂按原样本量继续开展临床研究。
第 2 次期中分析（入组 576 例患者中 550 例获得了主要疗效结果），2组间在第 90 天 SAQAF 临床显著变化的患者比例没有显著差异（P=0.051 3），DMC 决定继续试验并基于第 90 天的数据重新预估其总样本量为 920 例。
②疗效指标的适应性调整：针对原研究方案中次要疗效指标需要执行的平板试验，第一阶段研究过程中发现招募入组时多数受试者不愿意接受平板试验，或在平板试验后产生不适感，且多数中心的研究者们亦认为平板试验对于患者存在较大风险。为了保证临床试验进程和患者的安全性，DMC 建议方案删除次要疗效结局指标中关于平板试验的内容。
根据如上建议，研究团队修订了临床方案，在之后的阶段不再执行平板试验的评估。
本研究采用的适应性设计，在保证试验完整性、合理性及可行性的基础上，分别对初始方案的次要疗效指标（平板试验的相关评价）及样本量进行了调整，保证了试验的顺利开展，降低了临床研究失败的风险，使最终的统计检验能达到预先设定的目标，并同时能够控制Ⅰ类错误率。同时全面衡量风险效益比，保证了患者的安全性及依从性。
2.3 安慰剂对照最大化控制偏倚
药物临床试验的目的是评估和验证药物的安全性和有效性。为了客观评价试验风险和受益，临床试验一般应遵循随机、重复、盲法和对照的设计和实施原则。作为主要的对照形式之一，安慰剂与盲法是控制研究结果偏倚的另一个重要手段[29-30]。
在中药临床试验中，鉴于中药的疗效和起效机制方面的特点，现行政策法规鼓励使用安慰剂作为对照，对受试制剂进行优效性评价[31]。
丹红注射液为红棕色澄明液体，在实现双盲、安慰剂对照的试验方法上存在很大的操作难度。项目伊始，研究团体对如何进行丹红注射液安慰剂的制备及实现盲法进行了大量的前期调研和实践摸索：既要保证丹红注射液安慰剂满足安全、适用、相似和可控的基本属性，又要具有临床可操作性。
最终，在专家团队的共同努力下，对丹红注射液安慰剂的制备和保证盲法的实施步骤进行了最优化[5]：在外观一致性上，输液瓶由严格密封的遮光袋包好，使用棕色输液器滴入患者体内；在双盲的实施上，由 2 位专职护士进行专项操作，实施过程中不发生任何形式的接触，且在试验前签署保密协议。
其中，一位专职护士在专门的输液室进行药品配制，药品配置好后用遮光袋遮盖好输液瓶，而后由另一位专职护士将配置好的输液药品从输液室中拿出交给管床护士，并监督管床护士给患者输液（输液期间不能解开遮光袋，输完液后检查是否完好，以保证盲法的实施）。同时对研究者、患者和统计学专家均设盲。
从安慰剂的配置到双盲的实施，每一个步骤都周全考虑，且要求实施过程格外细致，遵循标准操作程序规范，确保做到安慰剂的安全、适应、与受试制剂相似（通过使用特制的棕色输液器克服这一缺陷），为项目数据的可靠性打下坚实的基础。
2.4 建立规范化的数据管理制度，提高临床试验的可靠性
临床试验的所有结果必须并只能通过数据反映出来，数据既是临床试验结果的证据，也是临床试验曾经存在过的唯一证据[32]。由于中药成分复杂，临床疗效多表现为“多作用靶点、低效应强度”，临床研究中呈现较多的测量偏倚。如何保证数据的准确、完整，从而提高中医药临床研究的质量和水平，是中医药临床研究中迫切需要解决的重点和难点问题[33]。
根据上市后临床研究特点，丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛临床研究实施过程中，强化各级人员质控过程监督，建立了规范化的质控体系（药品管理系统、中央随机系统、文档管理系统等）。同时，成立了独立的临床试验指导委员会、独立的终点评价/判定委员会及独立的 DMC[33]，用以完善临床过程管理，保证临床试验过程科学、严谨和规范。
中医药临床数据监查工作委员会(CMDMC)是在中医药临床研究中，独立于临床研究组织者、申办者/发起者和研究者之外的专家组[33]，不同于传统 DMC 工作方式，结合我国国情，CMDMC 除内部闭门会议和公开会议外，还包括对部分病例的有因现场核查工作[33]。
在本研究中，CMDMC 采用全过程、全覆盖、全跟踪的动态介入与管理，负责定期审查临床研究数据，监督整个临床研究质量和可能发生的安全性风险，为临床试验的研究者在试验过程中如何进行动态的累积数据分析、盲态数据审查与分析提供指导[34-35]。
同时，CMDMC 现场核查频率达 10 余次，对规范研究过程、防止试验进程中的偏倚、提高临床评价的一致性、确保数据的真实性和客观性及保护受试者安全等各临床试验质控各方面都起到了重要的作用。
丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛临床研究在国内较早地引入了数据监查工作委员会，并结合具体情况创新完善其工作流程，促进了临床质量及数据过程管理的提升，对于建立完整的中医药临床研究质量控制和质量保证体系，提高中医药临床研究质量，接轨国际水平具有重要意义。
三、发现机理，模块药理学框架下中药复方临床药效机制的探索
习总书记指出“我们要发展中医药，注重用现代科学解读中医药学原理”[36]。用现代技术的语言讲明白中药复方的临床药理机制，不仅是中医药现代发展的内在需求，更是国际化应用的重要基础及促进东西方文明互鉴的关键环节。中成药特别是复方中药强调多组分多靶点的协同作用。
如何突破其多成分、多靶点的表象，有效地寻找中药多组分与不同组学层面靶点间关系，系统描述及阐释这种相互作用关系对机体的整体调节作用，亟须研究方法上的创新[37]。随着系统生物学和网络药理学的兴起，整合疾病与药物靶点间复杂关系，为中药复方药理机制的研究提供了全新的视角和解决方案[38]。
然而，生物网络具有大数据量和高维度的特点，如何对大网络进行解码，降低分析的复杂性，在海量数据中有效地寻找中药多靶点作用间的关系是亟需突破的瓶颈[39]。
3.1 模块药理学技术框架——解析中药药理作用机制的新策略
课题组前期根据中医原创思维特点，基于网络药理学方法和多靶点治疗思路，结合生物网络的模块性、无尺度及小世界等重要特征，提出“模块药理学（modular pharmacology）”的研究方法及技术框架[40-41]，认为复杂疾病治疗需要一种模块化的靶点研究模式，强调对复杂生物网络进行模块化分析，用以度量和整合药物干预网络的特征[40]。
应用该技术方法，研究团队以中成药有效组分干预动物模型的数据为载体，展开了一系列的药理机制分析[42-44]，使该技术框架的理论与实践部分得到不断完善。
与此同时，首次将其引入基于临床研究的药理机制探索中，利用丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的多中心、大样本Ⅳ期临床研究结果及其全 RNA 组测序数据，旨在从基于临床的靶点模块层次揭示丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的多靶点、多态性调节机制，也为未来开展同类多靶点中药复方治疗优势病种的研究提供新的策略。
3.2 丹红注射液多靶点特征与靶点功能模块网络
既往系列研究显示，丹红注射液治疗冠心病具有多靶点的抗炎、抗氧化应激、抗凝、保护血管内皮、抗动脉硬化等药理学特性[45]。然而，从研究模式看，多集中在其治疗效应的某一通路、某一靶点或某大类功能层面，刻画模糊。丹红注射液治疗冠心病发挥保护作用的直接靶点和确切机制仍不清晰。
研究选取丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的临床研究中 2 个中心共 62 例患者（丹红组 41 例，对照组 21 例）开展了多时点的全 RNA 组测序（血清样本）。采用常规差异基因分析方法发现，与对照组比较，丹红注射液治疗前后 125 个差异表达基因富集出的生物学功能或通路尚无法解释丹红注射液治疗稳定性冠心病的多靶点药理机制。
因此，基于如上数据，进一步构建了第 30 天丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的加权基因共表达网络（WGCNA），且通过模块划分获得 38 个模块。
与安慰剂组比较后，将 Zsummary＜0[46]的 25 个差异表达模块（DEMs），定义为丹红注射液的靶点功能模块（targeted functional modules，TFMs），并利用模块间连通性评分（connectivity scores，CSs）首次勾画出丹红注射液的靶点功能模块网络(即每一个功能模块代表一个节点)。其中“信号转导-pi3k-akt 信号通路”靶点功能模块与抗炎、内皮细胞功能调节和动脉粥样硬化斑块稳定性相关；“miR-206 & OR2F1”靶点功能模块与调节胆固醇代谢和内皮细胞功能有关。
3.3 丹红注射液最佳疗效模块及其可变性测量
疾病的发生发展是体内综合平衡失调的过程，根据疾病发生的规律和特点，最佳的治疗模式是针对病理条件下不同环节的变化和特点进行有效的调节，即对发挥主导作用的靶点和环节进行重点调节[40]。在模块药理学框架中，药物的作用可能是通过影响某些重要的功能模块来实现[41]。
因此，获得丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛最佳疗效模块，是合理解释其临床有效性的最佳途径。在靶点功能模块网络基础上，在临床疗效最佳人群（心绞痛频率改善≥40）中，获得了与表型变化值（心绞痛频率改善）最相关的模块（r=0.909，P=0.004 6），并将该模块定义为最佳疗效模块（most effective therapeutic module，METM），其功能与抗凝机制相关（凝血的负调控）。
此外，通过对不同疗效群体中该 METM 的拓扑学结构的可变性分析进一步发现，METM 的全局拓扑相似性（D值）[42]随着疗效的增加而增加，同时模块中边的数量也随着药物疗效的增加而增加。这种对 METM可变性的全局的、整体的定量评价，证实了模块药理学框架提出“模块可变性”理论的正确性[40]，并发现这种拓扑结果可变性与疗效（表型变化）之间具有强相关性。
同时，基于模块结构的核心基因筛选能够获得有效的表型基因，如研究发现最佳疗效模块里有 6 个基因（ACSS3、SULT1A2、VTN、LRFN2、NPC1L1 和 NEURL3）与疗效改变具有较高的相关性，这些基因大部分存在于临床疗效有变化的人群中，但不存在于疗效无变化或恶化的人群中。
综上，与差异表达基因分析相比，靶点模块的分析方法，尤其是最佳疗效模块的确定及其在不同疗效人群中拓扑结构的可变性分析，最终将药理机制变化与临床疗效变化相关联，具有疗效表型相关性优势。该研究从模块层次首次揭示了丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的多靶点、多态性调节机制，同时，对于疗效模块可变性的测量为以患者为中心的个体化医疗路径提供了一个全新视角，即解构和重组模块单元可以作为探索个体化治疗的有效工具。
四、小结与展望
当前世界范围内正在兴起新一轮的科技革命，新理念、新方法的不断涌现，突破了固有思维形态和研究模式，正在催生中医药研究范式的转变。
几千年的中医药在临床实践中采用多种涉及多种成分的联合疗法治疗疾病，把疗效讲清楚，把机理说明白，是摆在中医人面前的重要任务。
现代临床研究既要遵循国际规范和指南，又要在坚守中医原创思维、传承文化精华的基础上，创新临床试验体制和机制，探索提高研究质量和效率的相应方法，积极成为国际临床研究方法的参与者与贡献者。
丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛临床研究以“肯定疗效，规范标准，发现机理”为统领思想，采用国际认可的指标评价体系、标准操作规范，证实了丹红注射液改善慢性稳定性心绞痛的有效性，为其临床应用提供循证证据，为上市后再评价提供技术支撑；同时该研究建立并应用了模块药理学分析技术，绘制了丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的以靶向功能模块构成的靶点网络图，为从网络和模块层面解析和优化多表型药理机制研究及精准治疗提供新的策略。该研究的探索模式希望为具有治疗优势的同类多靶点中药复方提供一种新的思路，促进中医药的创新性发展。
转自：“如沐风科研”微信公众号
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