血管性痴呆（vascular dementia，VD）属于脑血管损伤引起的一种痴呆亚型，可造成记忆力减退、认知障碍、情感异常等临床症状，是威胁中老年人健康并导致其痴呆的主要原因之一[1-2]。脑缺血缺氧是引发VD的常见病因，神经炎症、自噬和细胞凋亡在VD病理过程中起到关键调控作用[3]，抑制炎症、增强自噬作用可减轻神经元损伤，改善VD造成的认知障碍[4-5]。PTEN诱导激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/帕金蛋白（Parkin）是调节自噬的主要信号通路，可介导受损细胞器的清除和内环境平衡的维持过程，激活该信号可增强线粒体自噬，有益于炎症性疾病的治疗[6]，并可提升β-淀粉样蛋白诱导的大鼠学习记忆能力，改善阿尔茨海默症大鼠痴呆症状[7]。因此PINK1/Parkin可作为VD的潜在治疗靶点。槲皮素是广泛存在于银杏、山楂和三七等众多中药中的黄酮类化合物，具有雌激素样活性，可保护神经系统功能，改善阿尔茨海默症患者痴呆症状[8-9]，并可促进PINK1和Parkin蛋白表达，拮抗神经炎症，激活线粒体自噬，缓解大鼠脑缺血再灌注损伤[10]。本研究通过建立VD大鼠模型，探究槲皮素对VD诱导的大鼠海马神经元损伤及PINK1/Parkin信号通路的影响。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠，体质量200～240 g，购自康泰医学检验服务河北有限公司，动物许可证号SYXK（冀）2021-006。动物于河南大学第一附属医院屏障环境动物房中喂养，温度22～25 ℃，相对湿度50%～60%，明暗12 h交替循环。动物实验经河南大学第一附属医院伦理委员会批准（批准号2022079）。
1.2 药品与试剂
槲皮素（批号117395，质量分数为99%）购自美国Sigma公司；欧来宁胶囊（批号6916119040353，0.4 g/粒）购自石药集团欧意药业有限公司；大鼠5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）ELISA试剂盒（批号XY-SJH-DS1327）购自上海烜雅生物科技有限公司；大鼠乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）ELISA试剂盒（批号JL10299）购自上海江莱生物科技有限公司；Nissl染色液（批号C0117）、RIPA裂解液（批号P0013K）、BCA蛋白定量试剂盒（批号P0011）、大鼠白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（批号PI328）、IL-1β ELISA试剂盒（批号PI303）均购自上海碧云天公司；IL-17 ELISA试剂盒（批号SEKR-0007）购自北京索莱宝科技有限公司；PINK1抗体（批号ab23707）、Parkin抗体（批号ab77924）、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3）抗体（批号ab221794）、Beclin1抗体（批号ab62557）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号ab181602）、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（批号ab150077）购自英国Abcam公司；HRP标记的山羊抗大鼠IgG抗体（批号A-11029）购自美国CST公司。
1.3 仪器
DCS-2型大鼠程控穿梭箱（中国医学科学院药物研究所）；HT7700型透射电镜（TEM，日本日立公司）；ASP200S型全自动脱水机、G1150H型加热石蜡包埋系统、DM3000型显微镜（德国Leica公司）；1510型石蜡切片机（德国SLEE公司）；RMC POWERTOME XL型超薄切片机（美国RMC公司）；1658033型小型垂直电泳转印系统、15043型多功能酶标仪、Chemi-Doc XRS型化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。
2方法
2.1 VD大鼠模型的建立、分组及给药
参照文献方法[11]制备VD大鼠模型，SD大鼠禁食不禁水12 h，ip 2.5%戊巴比妥纳（45 mg/kg）麻醉，仰卧固定后颈部去毛、备皮、消毒，于正中切开，分离肌肉，钝性分离双侧颈总动脉后结扎，缝合大鼠伤口即完成模型制备。1周后通过穿梭箱实验筛选成模大鼠，与正常大鼠相比步入潜伏期（step-through latency，STL）显著降低且暗室中花费的总时间（total time spent in the dark chamber，TDC）显著升高即为造模成功，将其随机分为模型组、欧来宁（14.8 g/kg）[11]组和槲皮素低、中、高剂量（25、50、100 mg/kg）[12]组，每组12只，另取12只大鼠只分离双侧颈总动脉不对其结扎，作为假手术组。各给药组ig相应药物（10 mL/kg），假手术组和模型组大鼠ig等体积生理盐水，1次/d，连续21 d。
2.2 穿梭箱实验检测大鼠学习记忆能力
给药结束后，进行穿梭箱实验检测大鼠学习记忆能力[13]。穿梭箱系统由2个相同的空腔组成，1个有灯光刺激，处于照明状态，1个保持黑暗。将大鼠放入光腔室中，并引导其自由穿梭于2个空腔室中5 min，当大鼠再次进入暗腔室中时，以0.5 mA的电流给予电击刺激，直至大鼠逃至不通电的光腔室中，间隔5 min后重复同样的操作，如此进行训练1 d，使大鼠在5 min内不进入暗腔室；第2天，将大鼠置于光腔室中，以穿梭箱系统自带的软件记录大鼠进入暗腔室中所需的时间，即STL，并记录大鼠TDC，采用STL和TDC作为评价大鼠学习记忆能力的指标。
2.3 ELISA法检测大鼠脑组织Ach、5-HT水平和血清IL-6、IL-17、IL-1β水平
穿梭箱实验结束后，异氟醚麻醉大鼠，采集颈动脉血1.2 mL，4 ℃、1000 r/min离心15 min，取上清，于−80 ℃保存备用；然后断头处死大鼠，解剖取出大脑，取0.7 g脑组织，加入高效RIPA裂解液匀浆，4 ℃、3000 r/min离心20 min，取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，于−80 ℃保存备用。取脑组织蛋白样品液和血清于冰水浴中解冻，吸取0.2 mL脑组织蛋白样品液和0.3 mL血清，按照ELISA试剂盒说明书测定脑组织Ach、5-HT水平和血清IL-6、IL-17、IL-1β水平。
2.4 Nissl染色检测大鼠海马组织神经元损伤
取各组大鼠脑组织，于10%福尔马林中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后冠状切片，取含有典型海马组织结构的切片，经脱蜡、水化后，浸入Nissl染色液中进行染色、漂洗，以中性树胶封片，于显微镜下观察并拍照，神经细胞中的尼氏小体可被染为蓝紫色，正常神经元细胞尼氏小体数量多、染色较深且均匀，当其细胞受损时，尼氏小体染色较浅，数量大量减少。
2.5 TEM观察大鼠海马区神经元超微结构
取“2.4”项下各组含有典型海马组织结构的切片，脱蜡、水化后，于1%锇酸中固定，脱水，环氧树脂包埋，使用超薄切片机切片（厚度50～100 nm），于TEM下观察各组神经元超微结构，采集图像并评测自噬情况。
2.6 Western blotting检测大鼠脑组织PINK1/Parkin信号通路相关蛋白表达
取“2.3”项下各组脑组织蛋白样品液，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中封闭2 h，分别加入PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和GAPDH抗体，4 ℃孵育13 h；TBST洗涤3次，5 min/次，加入相应二抗，37.5 ℃孵育75 min；TBST洗涤3次，5 min/次，通过化学发光法显影后拍照，以Quantity One软件定量各条带灰度值。
2.7 统计学分析
实验数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析，计量资料以表示，两组间差异比较使用t检验；多组间差异比较进行单因素方差分析，进一步两两比较使用LSD-t检验。
3结果
3.1槲皮素对VD大鼠学习记忆能力的影响
如表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠STL显著降低（P＜0.05），TDC显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠STL均显著升高（P＜0.05），TDC均显著降低（P＜0.05），且呈剂量相关性。
3.2 槲皮素对VD大鼠海马神经元损伤的影响
如图1所示，假手术组大鼠海马神经元细胞尼氏小体数量众多，排列规整，染色深且均匀。模型组大鼠海马神经元细胞尼氏小体数量大量减少，排列紊乱，染色较浅，细胞损伤严重。与模型组比较，各给药组大鼠海马神经元细胞状态均有好转，尼氏小体数量增加，呈剂量相关性，槲皮素高剂量组和欧来宁组大鼠海马神经元细胞好转、恢复程度最强，与假手术组大鼠海马神经元细胞状态相当。
3.3 槲皮素对VD大鼠海马神经元自噬的影响
如图2所示，假手术组大鼠海马区神经元超微结构清晰，完整无损，线粒体外膜完整，整体呈长杆状或椭圆形，核膜完好无异常，未见明显自噬体。模型组大鼠海马区神经元超微结构受损，核周染色质聚集增多，线粒体固缩且数量减少，有少量自噬体产生，出现自噬现象。与模型组比较，各给药组大鼠海马区神经元超微结构受损减轻，核周染色质聚集减少，线粒体形态及数量有不同程度恢复，自噬体均增多，自噬现象增强，且随着槲皮素剂量升高，上述改变增强，槲皮素高剂量组和欧来宁组大鼠海马区神经元超微结构恢复及自噬情况相当。
3.4 槲皮素对VD大鼠脑组织Ach和5-HT水平的影响
如表2所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中Ach和5-HT水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中Ach和5-HT水平均显著升高（P＜0.05），且呈剂量相关性。
3.5 槲皮素对VD大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17和IL-1β含量的影响
如表3所示，与假手术组比较，模型组大鼠血清中IL-6、IL-17和IL-1β水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中IL-6、IL-17和IL-1β水平均显著降低（P＜0.05），且呈剂量相关性。
3.6 槲皮素对VD大鼠脑组织自噬相关蛋白表达的影响
如图3所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中自噬相关蛋白Beclin1和LC3II/LC3I表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中Beclin1和LC3II/LC3I表达水平进一步显著升高（P＜0.05），且呈剂量相关性。
3.7 槲皮素对VD大鼠脑组织PINK1/Parkin信号通路蛋白表达的影响
如图4所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中PINK1和Parkin蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中PINK1和Parkin蛋白表达水平均进一步显著升高（P＜0.05），且呈剂量相关性。
4 讨论
随着我国人口老龄化的加重，VD患病率逐年升高，极大削弱了患者的工作及自主生活能力，因看护和治疗花费大，给家庭造成沉重负担，已成为亟需解决的公共医疗卫生问题[14-15]。本研究以双侧颈总动脉永久性结扎法建立VD大鼠模型，可明显升高血清中炎性因子IL-6、IL-17和IL-1β水平，诱发并放大神经炎症，造成大鼠海马组织神经元严重损伤，且大鼠脑内与学习记忆能力密切相关的Ach[12]和神经递质5-HT[15]水平均显著降低，穿梭箱实验大鼠进入暗腔室中所需的时间显著降低，在暗室中停留更久，表明大鼠的学习记忆功能明显受损，出现认知障碍，说明VD大鼠模型构建成功。
研究发现，脑灌注不足引发的强烈炎症是VD的主要病理基础，另外自噬作用在其中也发挥着至关重要的作用[3,16]，促进自噬、减轻神经元炎症损伤是治疗VD的有效手段[16-17]。槲皮素作为一种天然黄酮化合物，可降低炎性因子表达，减少神经细胞凋亡，增强自噬活性，减轻脑缺血再灌注损伤[9,18]，并可通过抑制创伤性脑损伤后神经炎症，从而发挥显著的脑保护作用[19]。本研究结果显示，VD模型大鼠海马神经元内出现少量自噬体，脑组织中LC3II/LC3I及Beclin1蛋白表达升高，表明VD模型大鼠神经元自噬代偿性增强，会对神经元起到保护作用，但神经元损伤及超微结构受损严重，揭示VD模型大鼠神经元的自噬代偿性增强并不足以对抗其损伤，而以不同剂量的槲皮素干预VD大鼠，可降低大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-17和IL-1β水平，抑制炎症发生，提高自噬蛋白Beclin1及LC3II/LC3I表达，减轻海马组织神经元损伤及超微结构受损情况，增加神经元自噬体数量及穿梭箱实验中大鼠进入暗腔室中所需时间，升高脑组织Ach及5-HT水平，并减少大鼠在暗室中停留时间，且呈剂量相关性，揭示槲皮素不仅可减弱神经炎症，还可增强神经元自噬，从而缓解海马神经损伤，回复大鼠的学习记忆功能，发挥神经保护作用。
研究显示，PINK1/Parkin信号通路可通过调节线粒体自噬介导唐氏综合征、阿尔茨海默症等疾病的病理过程，上调通路蛋白PINK1、Parkin表达可明显增强细胞自噬活性，加快清除受损线粒体，减轻细胞氧化应激损伤[20]；过表达PINK1可激活自噬信号，抑制活性氧产生，改善线粒体功能障碍，缓解神经元损伤，从而改善阿尔茨海默症患者痴呆症状[21]，由此可见PINK1/Parkin信号可通过促进自噬减轻细胞损伤，进而推测槲皮素可能通过上调PINK1/Parkin信号通路而增强自噬，从而减轻血管性痴呆大鼠海马神经元损伤。本研究结果显示，VD大鼠脑组织中PINK1和Parkin蛋白表达升高，而经槲皮素处理后，两者表达进一步升高，表明PINK1/Parkin信号介导VD的病理过程，在VD发病过程中，PINK1/Parkin信号有所激活，激活自噬作用，对永久性结扎大鼠双侧颈总动脉后所引发的脑损伤有一定抵抗作用，但功效不强，而槲皮素不仅可抑制神经炎症，还可激活PINK1/Parkin信号，促进自噬，进一步增强细胞自噬对脑损伤的抵抗作用，最终达到改善大鼠学习记忆功能、减轻痴呆症状的作用。
综上所述，槲皮素可上调PINK1、Parkin蛋白表达，抑制炎性细胞因子合成和释放，缓解海马神经元炎症损伤，促进自噬，改善VD大鼠学习记忆功能，缓解其痴呆症状，激活PINK1/Parkin信号可能是其发挥以上作用的机制之一。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：唐 森，方 建，高立功，黄一苇．基于PINK1/Parkin通路研究槲皮素减轻血管性痴呆大鼠海马神经元损伤的作用机制 [J]. 中草药, 2022, 53(20): 6529-6535 .
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