功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是临床上最常见的功能性胃肠道疾病，是以持续或反复发作的上腹部症状如上腹痛或不适、腹部胀气、嗳气、厌食、恶心、呕吐、早饱、烧心、反胃等为特点的一组症候群[1]。FD的发病机制可能与胃肠运动异常、内脏高敏感、幽门螺杆菌感染、脑肠轴功能紊乱、肠道微生态失衡、十二指肠屏障受损与微炎症、遗传因素、精神、心理等因素密切相关[2]。目前治疗FD的主要方法包括促动力药物治疗、根除幽门螺杆菌治疗、抑酸治疗、心理辅助治疗等。质子泵抑制剂可以通过抑制盐酸分泌改善上腹部的烧灼感。但越来越多的证据表明，长期使用质子泵抑制剂会产生肝、肾毒性，增加患胃癌的风险[3-5]。
中医药在FD治疗上优势凸显，虽不如化学药迅捷，但疗效稳定，不良反应小，复发率较低。中医称功能性消化不良为“痞满”，属于“胃脘痛”“胃痞”范畴[6]。枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙C. sinensis Osbeck的干燥幼果，具有破气消积、化痰消痞的功效，常用于治疗积滞内停、痞满胀痛、大便不通等症，能够缓解FD引起的胸腹痛，对FD有显著疗效[7-8]。目前枳实治疗FD疗效确切，但其药效物质基础尚未完全明确。本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术分析10批不同产地枳实水煎液的共有成分，结合药效数据构建化学成分相对含量与治疗FD药效的关联性，并采用斑马鱼蠕动模型对药效物质进行验证，筛选出有效、可测的质量标志物，为枳实的质量标准提升提供参考。
1 材料
1.1 动物
SPF级SD雄性大鼠，体质量（200±20）g，购自哈尔滨医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK（黑）2013-001。动物饲养于温度25～28 ℃、相对湿度50%～70%，光照14 h/黑暗10 h的环境中。动物实验经哈尔滨商业大学药学院实验动物伦理委员会批准（批准号180315）。
野生型AB系斑马鱼由山东省科学院生物研究所提供，饲养于本实验室循环养殖系统中。动物实验经哈尔滨商业大学药学院实验动物伦理委员会批准（批准号200318）。
1.2 药材
10批枳实药材由首都医科大学中医学院罗容副教授收集并鉴定为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果，详细信息见表1。
1.3 药品与试剂
对照品柚皮苷（DSTDY009902）、圣草次苷（DST211225-014）、橙皮苷（DST211108-038）、新橙皮苷（DSTDX003901）、辛弗林（DSTCP110727），均购自天津一方科技有限公司，质量分数≥98%；色谱甲醇、乙腈购自德国默克公司；蒸馏水购自屈臣氏；氯化钠注射液（批号16031609）购自哈尔滨药业集团三精药业股份有限公司；多潘立酮（批号LJJ2K49）购自西安杨森制药有限公司；尼罗红（批号S19279）、盐酸洛哌丁胺（批号S26615）购自上海源叶生物科技有限公司；三卡因（批号C1259391）购自天津阿尔法生物科技有限公司；胃泌素ELISA试剂盒（批号DRE20863）和胃动素ELISA试剂盒（批号DRE10129）购自上海邦奕生物科技有限公司。
1.4 仪器
超高效液相色谱仪（UPLC，美国Waters公司）；AB Sceix Triple TOFTM5600型质谱仪（美国应用生物系统公司）；斑马鱼养殖系统（上海海圣生物实验设备有限公司）；DMI3000B型荧光显微镜（德国Leica公司）；680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）。
2 方法
2.1 不同批次枳实水煎液的化学成分分析
2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取10批枳实药材粉末各0.5 g（过60目筛），放入圆底烧瓶中，加入10倍的蒸馏水，回流提取2次，每次1 h。合并2次滤液，浓缩，定容至25 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过，得到供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取辛弗林、圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷对照品各1.0 mg，分别加甲醇超声溶解，于5 mL量瓶定容，制成0.2 mg/mL的对照品溶液。
2.1.3 色谱条件 Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～13 min，90%～62% A；13～26 min，62%～10% A；26～28 min，10%～90% A。柱温35 ℃；进样体积0.5 μL；体积流量0.2 mL/min；检测波长274 nm。
2.1.4 质谱条件 ESI离子源；正离子模式扫描；碰撞能量15 eV；干燥气温度320 ℃；体积流量8 L/min；雾化器压力241.325 kPa；毛细管电压3500 V；鞘气温度350 ℃；鞘气体积流量11 L/min。数据采集采用高分辨率模式，扫描范围m/z100～3000，采样速度为1 spectra/s。
2.2 不同批次枳实对FD的治疗作用
2.2.1 给药溶液的制备 取10批枳实药材，按“2.1.1”项下方法制备，取适量浸膏，加水溶解成质量浓度为0.103 g/mL的溶液，备用。
2.2.2 分组、造模与给药 大鼠适应性喂养1周，随机分为13组，每组8只，分别为对照组、模型组、多潘立酮（1.03 mg/kg，多潘立酮片研磨成粉末，用生理盐水配制成0.103 mg/mL的溶液）组以及10个批次的枳实（2.06 g/kg，相当于临床剂量的2倍）组。除对照组外，其余各组采用不规则喂养和夹尾刺激法建立大鼠FD模型[9-10]。大鼠正常饮水，隔日禁食，每天用长海绵钳夹大鼠尾部远端1/3处，每次0.5 h，每隔3 h刺激1次，4次/d，连续14 d。造模结束后，恢复正常的饮食和饮水，各给药组ig相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积生理盐水，1次/d，连续14 d。
2.2.3 一般行为学观察 对实验过程中大鼠的食物摄入量、水摄入量、体质量、活动度、毛发、粪便等进行观察和评估。
2.2.4 胃排空率和小肠碳末推进率测定 将羧甲基纤维素钠溶于250 mL蒸馏水中，然后分别加入10 g淀粉、8 g糖、8 g淀粉和2 g活性炭粉末，均匀搅拌，制成300 mL的碳末糊，于4 ℃保存。各组大鼠禁食24 h，ig碳末糊（10 mL/kg），30 min后麻醉，摘眼球取血，脱臼处死。打开腹腔，结扎胃贲门和幽门，取胃，擦干，称定胃全质量，然后剪开胃体，洗去内容物后擦干，称定净质量；同时，迅速取出小肠，铺于白瓷盘上，测量幽门至回盲肠部全长及幽门至碳末前沿的距离。计算胃排空率和小肠碳末推进率。
胃排空率＝[ig碳末糊质量－(胃全质量－胃净质量)]/ig碳末糊质量
小肠碳末推进率＝碳末推进距离/小肠全长
2.2.5 血清胃动素、胃泌素的测定 各组大鼠血样于室温下静止20 min，3000 r/min离心20 min，分离血清，按试剂盒说明书测定血清中胃动素及胃泌素水平。
2.3 谱效相关性分析
2.3.1 灰色关联度分析 灰色关联度分析是一种多因素统计分析方法，对原始数据采用均值变化法进行无量纲处理，分别将小肠碳末推进率、胃排空率、胃动素和胃泌素4个药效指标作为母序列，枳实10批次35个共有峰峰面积作为子序列，计算关联度（r）。
2.3.2 Pearson双变量相关性分析 以10批枳实35个共有峰峰面积为自变量，4个药效指标为因变量，通过皮尔森双变量相关性分析计算两者之间的Pearson相关系数。
2.4 枳实单体成分对斑马鱼肠道蠕动的促进作用
2.4.1 最大耐受浓度测定 随机选取180尾受精后6 d（6 day post fertilization，6 dpf）的斑马鱼胚胎于6孔板中，每孔30尾，分别加入3 mL质量浓度为125、250、500、1000、2000 μg/mL的药物（圣草次苷、辛弗林、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷），同时设置对照组（不含药物）。处理24 h后，观察并记录斑马鱼的死亡情况，确定各药物对斑马鱼的最大耐受浓度。
2.4.2 斑马鱼肠道蠕动模型的建立及给药 斑马鱼在5 dpf表现出自发的节律性肌肉收缩，开始外源性自发进食[11]。将140尾5 dpf的野生型AB斑马鱼置于6孔板中，每孔20尾，设置对照组、模型组、多潘立酮（30 μg/mL）组、圣草次苷（250 μg/mL）组、柚皮苷（250 μg/mL）组、橙皮苷（250 μg/mL）组、新橙皮苷（250 μg/mL）组和辛弗林（250 μg/mL）组。各组加入3 mL尼罗红（10 μg/mL），作用16 h后清洗3遍。除对照组外，其余各组给予3 mL盐酸洛哌丁胺（20 μg/mL）造模，对照组用胚胎培养水正常培养。造模同时，各给药组给予3 mL相应药物，对照组和模型组给予等体积胚胎培养水，于28 ℃恒温水浴避光培养24 h。
2.4.3 斑马鱼的肠蠕动促进率测定 按“2.4.2”项下方法给药24 h后，用0.02%三卡因进行麻醉。各组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下对胃肠部进行拍照，采集斑马鱼肠道内容物（尼罗红）荧光强度（S），用Image J图像处理软件进行统计，计算肠蠕动促进率。
肠蠕动促进率＝1－(S给药－S对照)/(S模型－S对照)
2.5 统计学分析
结果以表示。所有数据均通过IBM SPSS Statistics 21.0软件进行分析，多样本组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD多重比较分析。
3 结果
3.1 枳实水煎液特征图谱的建立
对正离子模式下10批枳实水煎液基峰离子色谱图（base peak chromatograms，BPC）进行叠加（图1-A），共标记35个共有峰（图1-B）。通过对比保留时间，分析一级、二级质谱信息并结合相关文献报道，对共有峰成分进行分析鉴定，结果见表2。
3.2 枳实对FD的影响
3.2.1 一般行为学观察 对照组大鼠饮水、饮食、皮毛色泽、粪便无明显变化，精神状态良好，体质量增加。模型组大鼠饮水量和饮食逐渐减少，皮毛呈黄色，粪便柔软，气味恶臭和刺鼻，精神状态差，容易被激怒，体质量下降。与模型组相比，给予多潘立酮和不同批次枳实干预后，大鼠饮水量、进食量逐渐增加，皮毛恢复光泽，粪便干燥，气味稍脏，性情温和，体质量趋于正常水平。
3.2.2 胃肠动力及血清药效指标测定 如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠胃排空率、小肠碳末推进率及血清中胃动素、胃泌素水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠胃排空率、小肠碳末推进率及血清中胃动素、胃泌素水平均显著升高（P＜0.01），且10批枳实组间无显著差异。
3.3 谱效指标相关性分析
通过灰色关联度法和Pearson双变量相关性分析计算35个共有峰峰面积与药效指标的关联度，灰色关联度数值越大，表明色谱峰代表的化学成分与药效指标关联性越大。成分与药效指标的灰色关联度值如图3-A所示，根据平均关联度值大于0.7进行筛选，共筛选出10个与药效指标相关性强的成分，相关性程度依次为峰1＞峰3＞峰14＞峰34＞峰17＞峰2＞峰30＞峰33＞峰25＞峰35。成分与药效指标的Pearson相关系数值如图3-B所示，根据平均值大于0.6筛选出与4个药效指标呈正相关的成分，相关性程度依次为峰3＞峰14＞峰33＞峰35＞峰34＞峰30＞峰25＞峰1。综合分析2种方法可知辛弗林（峰3）、马尔敏（峰14）、黄柏酮（峰25）、N-甲基酪胺（峰1）、圣草次苷（峰33）、柚皮苷（峰30）、橙皮苷（峰34）、新橙皮苷（峰35）8个成分与枳实治疗FD关联性较强。结合文献报道及相关性结果，选择相关性较高、易得、可测的圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林5个成分进行斑马鱼肠道蠕动模型验证。
3.4 枳实单体成分的最大耐受剂量测定
如图4所示，圣草次苷、辛弗林、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷5个单体成分在125～500 μg/mL质量浓度下，斑马鱼无死亡。1000、2000 μg/mL质量浓度下有不同程度的死亡，因此本研究中5个单体对斑马鱼的最大耐受剂量为500 μg/mL。
3.5 枳实单体成分对斑马鱼肠蠕动的促进作用
如图5和表3所示，与对照组比较，模型组斑马鱼肠道内容物荧光强度明显增强（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组斑马鱼肠道内容物荧光强度明显降低（P＜0.01），其对斑马鱼肠道蠕动的促进效果依次为新橙皮苷＞柚皮苷＞辛弗林＞橙皮苷＞圣草次苷。
4 讨论
中医学认为FD属于“痞满”“胃脘痛”“积滞”等范畴，主要与情志不畅、外邪侵袭、饮食所伤、脾胃虚弱等因素有关，临床上中医辨证施治，以健脾和胃、理气降逆为主[16]。枳实具有破气消积、化痰消痞的功效，为中医临床治疗FD的常用中药之一，以其为君药的复方如枳实消痞丸[17]、枳实导滞丸、枳术丸、四逆散[18]等治疗FD也取得了良好疗效，但其药效物质基础尚不明晰。
本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对10批枳实的水煎液进行分析，对色谱图进行叠加获得共有峰，确认了35个共有峰，通过保留时间以及文献信息对共有峰成分进行分析鉴定。其次，采用不规则喂养和夹尾刺激复合因素建立FD大鼠模型，通过观察大鼠行为学以及枳实对大鼠胃排空率、小肠推进率及血清中胃动素、胃泌素水平的影响，探究枳实对FD大鼠的影响[19]。进一步运用化学计量学方法建立枳实图谱数据与中药药效活性的内在联系，有助于探明药效物质基础，能够推测与药效相关的成分群[20]。灰色关联度分析能够很好地识别出与药效具有较高相关性的峰，但不能精确识别出正相关或者负相关；而Pearson双变量相关性分析可以筛选出与药效呈正相关的成分。本研究将2种方法相结合，初步筛选出辛弗林、马尔敏、黄柏酮、N-甲基酪胺、圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷与枳实治疗FD的关联性较强。研究发现，辛弗林能够显著提高胃泌素和辛酰化饥饿激素的含量，更好地促进胃肠蠕动[21]；橙皮苷能够促进胃动素的释放，增加胃排空率和小肠碳末推进率，促进胃肠动力，从而改善FD症状[22]；新橙皮苷具有较好的抗氧化作用，可以改善胃黏膜损伤，增加黏液含量，且可显著降低胃酸分泌和排出，增加胃pH值，促进胃肠动力[23]；辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷能够影响胃肠激素分泌，从而促进脾虚模型大鼠的胃肠运动[24]。枳实的主要药效成分为生物碱和黄酮2类物质，黄酮类成分含量较高，占5%～28%，为促进肠胃蠕动的主要成分[25-26]；生物碱类成分为强心、升压的主要成分[25]，其中辛弗林也具有促进胃肠道蠕动的作用[21]。本研究通过谱效相关性筛选出的8个成分中，马尔敏不易获得，N-甲基酪胺在枳实中含量较低，黄柏酮与药效指标相关性相对较低。因此从8个成分中选出与药效相关性高、易得、可测的圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林5个成分进行斑马鱼肠道蠕动模型的验证，结果表明5个单体均能促进肠道蠕动，为枳实治疗FD的药效物质。
本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，采用FD大鼠模型和斑马鱼肠道蠕动模型阐明了枳实治疗FD的药效物质，并筛选出潜在药效物质基础，对枳实药材、饮片及制剂的质量标准提升具有重要的参考价值。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：曲中原，李苏楠，孙志伟，孙向明，于佳慧，舒 淇，邹 翔，罗 容．枳实化学成分与治疗功能性消化不良关联性分析及实验验证 [J]. 中草药, 2022, 53(20): 6521-6528.
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