单细胞测序（single-cell sequencing）是近几年非常热门的研究方向,可以很好揭示出每个细胞独特的微妙变化，以及揭示全新的细胞类型。它推进了基因组学领域研究进展，使不同细胞类型得以精细区分，让单细胞水平分子机制研究成为可能。如何利用这种新兴技术帮助自己更好的进行学术研究呢？接下来这篇文献使用单细胞测序技术揭示结直肠癌的潜在治疗机制，值得借鉴学习。
2022年7月1日首发在EBioMedicine（IF：11.205），题为“Single-cell sequencing reveals CD133+CD44−-originating evolution and novel stemness related variants in human colorectal cancer”的文章由温州医科大学附属第二医院放射科的吴式琇医生带领团队发表。研究揭示了结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）的克隆进化和新的CRC标记物，并证明了CRCICs（CRC起始细胞，也称干细胞）在CRC的发生和发展中的重要作用。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104125
研究背景
CRC是全球癌症发病率（9.2%）和死亡率（9.8%）的主要原因之一。CRC细胞具有高度异质性，其异质性增加与生存率相关。然而，细胞间异质性促进结直肠癌发生的综合机制尚未完全阐明。CRCICs称为癌症干细胞，具有自我更新能力和产生其他分化后代的潜力，有研究表明，CRCICs在肿瘤发生、肿瘤复发和治疗耐药性中具有重要作用。本研究中，作者对CRCC（EpCAM+细胞）和三个CRCIC亚群（E/133+44+细胞、E/133+细胞、E/44+细胞）进行了单细胞全外显子组测序，以确定不同亚群间CRCIC的整合遗传和进化机制。然后对另外20例结直肠癌患者进行功能分析和靶向外显子组测序（TES）验证结果。为结直肠癌患者的靶向治疗和免疫治疗提供新的潜在CRCIC生物标记物和靶点。
研究内容
1.CRC患者的异质性CRCIC
作者通过对20名CRC患者样本进行靶向测序。收集一名结直肠癌患者（患者CRCIC scWES）（图1）的结直肠癌组织，然后单细胞全外显子组测序（single-cell whole-exome sequencing，scWES）表征CRCICs。通过生物信息学、靶向测序和比较101个CRC单细胞等技术手段在CRC单细胞中观察到广泛的突变谱，深度范围为136-449X, 20X平均覆盖率为88.3%。
图1.研究概述
2.在CRC单细胞中发现突变特征
为识别高危突变，作者首先通过与正常结直肠上皮组织的WES数据进行比较，去除单核苷酸多态性（SNPs），然后应用ANNOVAR进行变体注释。作者通过非负矩阵分解算法分解体细胞SNV谱，发现肿瘤组织的五个特征（图2，特征A、B、C、D和E），使用相同算法对每组细胞（三个CRCIC组和CRCC）的突变谱进行分解，结果显示CRC与特征码6相似，表明可以在单细胞水平上发现结直肠癌的新突变特征码。
图2.CRCIC和CRCC的突变谱和突变特征
3.CRCIC单细胞突变特征
作者通过GATK（基因组分析工具包）在单个CRCIC和CRCC中识别了291个体细胞突变位点。CRCICs和CRCCs表现出不同的突变特征，存在118个体细胞突变位点，另有135个突变在CRCICs中特异性突变（图3a）。然后作者分析了三个CRCICs亚群所共有的特定突变基因如CDH1、ARHGAP39是否与干细胞的干性相关。FACS分析表明CDH1、ARHGAP39、LURAP1L、PCGF2和MBD4与干细胞的干性呈正相关，敲除它们中的每一个都可以增加CD133+和/或CD44+细胞的比例。
图3.scWES数据的CRCICs特定SNV谱
4.CRCICs，尤其是E/133+细胞是CRC克隆进化的起源
作者使用OncoNEM算法对scWES数据处理获得了两个克隆进化分支（图4a），所有克隆进化分支都预测CRC起源于E/133+CRC，在第一阶段发生突变，突变最少。E/133+44+和E/44+细胞在第二阶段发生突变，E+细胞最后分支并在第三阶段发生突变。
图4.scWES和TES数据的CRCICs和CRCCs的克隆进化及其对CRC细胞系的验证
5.scWES数据和TES数据鉴定的干细胞干性相关基因功能分析
作者进一步通过干细胞相关基因功能分析验证了45%的CRC患者至少存在一种干细胞特异性突变基因AHNAK2、PLIN4、HLA-B、ALK、CCDC92和ALMS1的突变（图5）。作者使用敲除实验来评估共突变基因AHNAK2、ALK、ALMS1、HLA-B、CCDC92和PLIN4的干细胞特征，发现除上述六个基因外，在所有CRC患者中，倾向于在癌症起始细胞中发生突变。
图5.在scWES数据和靶向测序数据中发现的相同CRCICs突变位点或突变基因，以及对这些突变基因的敲除表达分析
6.潜在治疗靶点
接下来作者分析了scWES数据和TES数据所有突变的新抗原，发现AHNAK2、PLIN4、HLA-b和ALK这些基因可能作为CRCICs的预后标志物，也可能作为抗体介导免疫治疗的靶点。在scWES和TES数据中，AHNAK2、PTPRF和NPIPA5基因的特异性新抗原肽也显示出高肽交换（图6）。这些新抗原可能用于CD8介导的CRC免疫治疗，值得进一步研究。
图6.AHNAK2、PTPRF和NPIPA5基因起始细胞特异性新抗原肽及其相应野生肽的MHC结合亲和力
研究总结
CRC是在结肠隐窝中累积的突变负荷超过一定阈值时发生的，导致克隆扩增和最终的肿瘤转化。随着单细胞测序技术的发展，CRC细胞表现出多种突变，携带的体细胞突变数是正常结直肠细胞的数倍。CRC容易复发和转移，部分原因是CRC细胞的持续存在。在这篇研究中，作者观察到CRCC起源于CRCICs，甚至来自CD133+CRCICs，应用靶向测序和功能分析验证HNAK2、PLIN4、HLA-B、ALK、CCDC92和ALMS1基因均显示干细胞特征，可能代表CRCICs的预后标志物。作者还发现了上述基因的几种新抗原，可用于未来患者的精确治疗。然而这篇研究中作者仅初步发现这些基因与CRCICs之间的关系，没有进一步进行点突变相关的功能验证，突变基因与CRCIC之间的关系和机制尚不清楚。总而言之，这篇研究是来自scWES方面的CRCICs报告，揭示了关于CRCICs的更多信息以及克隆进化和突变特征的研究，包括结合scWES数据和体细胞靶向测序的CRCICs新抗原，为进一步研究CRC奠定了基础。
作者介绍
吴式琇
吴式琇医生长期从事恶性肿瘤发病机理和治疗研究，在肿瘤治疗方面有多项创新性成果，以第一作者或通讯作者发表学术论文近70篇，其中 SCI 收录30余篇。主持的《鼻咽癌综合治疗及多中心临床研究》获浙江省科技厅重大与高发疾病防治专项、温州市科技局重大项目资助，现承担包括国家自然科学基金在内的多项国家级和省市级科研项目，科研经费达200余万。
转自：“学术查”微信公众号
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