英文原题：Identification of a Bile Acid-Binding Transcription Factor in Clostridioides difficile Using Chemical Proteomics
通讯作者：Aimee Shen副教授，塔夫茨大学
供稿人：孔令昊，北京大学
大家好，今天为大家推荐一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，其标题为“Identification of a Bile Acid-Binding Transcription Factor in Clostridioides difficile Using Chemical Proteomics”。本文通讯作者是来自美国波士顿塔夫茨大学的Aimee Shen副教授，她们课题组专注于病原体侵染人类机体的分子机制方面的研究。本文中，作者基于化学蛋白质组学策略和有机合成技术，设计并合成了石胆酸类似物探针，成功鉴定了石胆酸的生理环境下的直接底物蛋白及其底物蛋白在生理环境下的生物学功能。
艰难梭菌是一种革兰氏阳性厌氧细菌，是全球获得性肠胃炎的主要原因。之前的研究中指出，由于对氧气极其敏感，艰难梭菌只能通过耐氧孢子进行传播和定殖，进而引发艰难梭菌感染（CDIs）。而在其定殖的过程中，内源肠道菌群主动进行抵抗，进而防止艰难梭菌引发肠道稳态紊乱。研究者猜测，肠道菌群产生的次级胆酸很可能是这一定殖抑制机制的主要分子基础。然而，次级胆酸的分子靶标还没有被成功鉴定。
图1. 化学蛋白质组学探针实现次级胆酸LCA抑制艰难梭菌生长的分子机制的示意图
为了解决这一问题，在本文中，作者首先对次级胆酸分子进行了改造，试图对次级胆酸的分子靶标进行寻找（图1）。在次级胆酸中，石胆酸（LCA）作为最有效的艰难梭菌抑制剂分子，受到的他们的关注。于是，他们针对LCA的分子结构进行了探针的设计与改造（图2.A）。一方面，他们在LCA甾体环上加上双吖丙啶基团，用于相互作用蛋白的直接捕获。另一方面，他们在甾体环羟基上或在羧基上衍生出一个炔基基团，用于后续的生物正交标记与富集。由此，他们得到两种LCA衍生物探针，探针-3和探针-8，并对其抑制活性进行了评价。结果显示，相比于天然LCA来说，探针-8展现出与LCA或者LCA异构体相当的抑制活性，而探针-3则没有明显的抑制效果（图2.B）。基于这一结果以及他们想要找到LCA抑制生长的分子靶点的初衷，他们将探针-8作为后续的实验组探针，将探针-3作为对照组探针，进行了后续的实验。
图2.基于化学蛋白质组学策略的 LCA类似物探针的设计与表征。A. LCA及其类似物探针-3/8的结构式；B. 探针-3和探针-8及一系列常见胆酸分子处理下的艰难梭菌生长曲线；C. 探针-8相互作用蛋白的捕获流程示意图。
基于经典化学蛋白质组学的策略，作者设计了如下实验（图2.C）。他们在培养的艰难梭菌的培养环境中分别加入上述两种探针，并通过UV激活交联反应，使LCA衍生物探针对相互作用蛋白进行标记。在完成艰难梭菌蛋白质组的提取后，他们通过“点击化学”（click chemistry）的策略，在LCA探针结合的蛋白上标记上荧光团或者生物素基团，并以此进行后续基于凝胶电泳和LC-MS/MS生物学评价。
图3. LCA的直接作用靶标鉴定。A. 探针-8的蛋白质组学标记的胶内荧光检测结果；B. 探针-3和探针-8富集组的非标定量蛋白质组学分析韦恩图；C. 探针-8与过表达的BapR-flag的免疫共沉淀鉴定两者之间的相互作用；D. 蛋白热稳定性分析实验鉴定LCA与BapR之间的相互作用；E. 表面等离子体共振实验鉴定 LCA与BapR之间的相互作用；F. 蛋白热稳定性分析实验鉴定探针-3/8与BapR之间的相互作用。
从荧光胶结果上，我们可以看到，LCA探针的标记反应呈现出紫外光依赖和剂量依赖的现象（图3.A）。为了对凝胶电泳中出现的LCA探针直接作用靶点进行分析，他们对探针标记的蛋白组进行了组学分析。无标定量的蛋白质组学分析结果显示，在探针-3和探针-8处理的蛋白质组分辨标记了52种和48种蛋白质，其中有27种是探针-8特有的标记底物（图3.B）。他们猜测，这27种蛋白与基于LCA的生长抑制机制很可能具有相关性。因此，他们对这27种蛋白进行了逐一分析。
经过了生物信息学分析，他们惊喜地发现，有一种非必须的MerR家族的转录因子蛋白BapR（胆酸结合蛋白调节蛋白）被显著富集了。而MerR家族的转录因子通常与外排过程的调节有关。一方面，它们可以感知并排出有毒分子。另一方面，它们可以根据分子对应配体的存在与否来对基因进行激活或抑制调控。基于这一知识，他们对BapR在这一过程中的功能进行了分析与解析。
iTASSER结构模型预测结果显示，BapR与之前报道的枯草芽孢杆菌中的MerR家族转录因子BmrR具有高度同源性与相似性，且N端的DNA结合结构域和C端可变配体结合域具有非常高的保守性。因此，BapR很可能具有与BmrR类似的结合疏水分子的能力。基于此，他们进行了免疫共沉淀实验，试图证明BapR与探针的直接相互作用能力（图3.C）。他们用探针-3和探针-8对表达了带有flag亲和标签的BapR蛋白的艰难梭菌裂解液进行了标记，同时依然通过“点击化学”策略，对标记到的蛋白进行生物素化衍生。后续使用基于链霉亲和素-生物素相互作用的富集策略，将生物素化衍生的蛋白富集出来，再进行flag标签信号的检测。结果显示，探针-8可以有效地把BapR富集出来，这意味着BapR确实与探针-8之间具有相互作用。为了进一步确认BapR与LCA的相互作用，他们使用蛋白热稳定性分析实验（thermo shift assays）对BapR在LCA处理下的热稳定性进行了测试（图3.D, F）。结果显示，探针-8和多数胆酸一样，在测试中显著影响了BapR结构稳定性，即在16 μM探针-8的处理下，BapR的Tm值下降了接近3℃。此外，后续的基于LCA的表面等离子体共振实验也得到的类似的结论（图3.E）。这些结果表明，BapR是生理环境下LCA的直接分子靶标。
图4.BapR在 LCA处理下的生化功能研究。A. LCA对BapR敲除及回补前后的艰难梭菌的生长抑制曲线；B. LCA对艰难梭菌细胞长度的表型统计图；C. LCA处理前后BapR表达量差异的表征；D. 胆酸处理下BapR积累量的免疫印迹表征结果。
为了进一步对基于BapR与LCA的相互作用机制进行解析，他们对LCA处理过程中的生理生化指标进行解析。他们发现，BapR的敲除无法解除LCA对艰难梭菌的生长抑制作用（图4.A）。但是缺失了BapR的艰难梭菌的细胞长度与野生型相比增加了约四分之一（图4.B）。此外，他们意识到，LCA处理之下的野生型艰难梭菌中，BapR的表达量被显著下调了（图4.C）。但是与此同时，随着LCA等胆酸浓度的增加，BapR的积累量也随之增加了（图4.D）。这意味着，在生理环境下，LCA的加入使得BapR的稳定性升高了。RNA-seq结果显示，BapR敲除后有三个基因位点的表达显著上调（图5.A,B），而其中的mdeA-cd3576 在处理前后的表达差异最为显著（图5.C），这意味着BapR抑制了其在LCA处理下的表达。后续的电泳迁移率转移试验（EMSAs）指出，BapR直接结合mdeA的启动子区，很可能由此来对mdeA的表达水平进行调控。
图5. BapR敲除前后对在 LCA处理下艰难梭菌中基因转录与表达过程的影响。A. BapR敲除前后的RNA-seq结果；B. 三个靶标的基因组背景示意图；C. BapR敲除前后的mdeA在LCA处理前后表达量差异的表征。
综上，本文作者基于化学蛋白质组学策略和有机合成技术，成功设计并合成了次级胆酸LCA类似物探针，并成功鉴定了LCA探针的直接生理环境下的分子靶点BapR及其下游基因转录表达机制。这一发现对研究者研究和理解艰难梭菌的基于胆酸的抑制机制，以及对于后续开发基于胆酸的药物来说，具有及其重要的作用与意义。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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