中国全科医学, 2022,25(36) 巫婷, 刘珏.
摘要
检测阴性设计是一种简便、快速且有效的研究方法，被广泛应用于疫苗上市后效果评价，有助于国内外基层医疗卫生机构及其他卫生机构评估疫苗上市后效果及其他干预措施效果，其应用前景广阔。随着实时检测阴性设计、整群随机检测阴性设计等新型衍生设计类型的出现，该研究设计被逐步应用于疾病危险因素探索、干预措施效果评估等。然而目前国内相关研究报道较为缺乏。本研究介绍了检测阴性设计的定义、基本原理、方法、设计实施要点，以及实时检测阴性设计、整群随机检测阴性设计等最新衍生设计类型、优势、局限性，在疫苗上市后效果评价以及其他干预措施效果评估等方面的应用，为国内学者开展相关研究提供理论与实践依据。
1980年，检测阴性设计（test-negative design，TND）首次探索应用于对肺炎链球菌疫苗的效果评价[1]。TND研究者通常招募因同一症候群到医疗卫生机构就诊的患者，将特定疾病检测阳性者归为病例组、检测阴性者归为对照组，比较两组间研究因素暴露状况的差异，从而评价该因素与检测结果之间有无关联及其关联程度。与经典的病例对照研究相比，TND很大程度上可以减少因就医行为带来的偏倚，且在研究成本和伦理的限制下，是一种有效且更为便捷的研究设计[]。
近年来，TND被广泛应用于疫苗上市后的保护效果评价，疫苗所针对的病原体包括呼吸道病原体（流感病毒[]、新型冠状病毒[]、肺炎链球菌[]等）、胃肠道病原体（轮状病毒[]、霍乱弧菌[]等）、其他（脊髓灰质炎病毒[]、人乳头瘤病毒[]、肠道病毒71型[]等），TND通过比较病例组与对照组之间的疫苗接种情况进而评价疫苗的效果。此外，该设计方法也可用于各种危险因素及干预措施的效果评价[]。目前国内关于TND的研究或文献报道较为缺乏。因此，本研究对TND的基本原理、方法、设计实施要点、衍生研究类型、优势、局限性及其应用进行介绍，为国内学者开展相关研究提供参考依据。
01
定义及基本原理
1.1 定义
TND是一类将目标疾病检测结果作为分类标准的研究方法[]。该方法的研究对象从因同一症候群就诊于某医疗机构的门诊或住院患者中招募，收集所有研究对象的研究因素暴露状况，如疫苗接种状态、干预接受情况等。对研究对象进行目标疾病病原体诊断检测，如流感的实时逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，rRT-PCR），将检测结果呈阳性者归为病例组，呈阴性者归为对照组，通过比较两组间研究因素暴露情况的差异来评价暴露因素对结局的影响或效果[]。TND研究流程示意图见图1。
图1TND研究流程示意图
Figure 1Schematic diagram of the test-negative design
1.2 基本原则[]
1.2.1 对照组与病例组须来自同一源人群
是研究的基本原则，若对照组与病例组来自不同源人群，研究结果将失去真实性。这条原则在TND中基本能满足，病例组和对照组通常选择的是因同一症候群而就诊于某医疗卫生机构的患者。
1.2.2 对照组和病例组有相同的病原体暴露风险
为保证对照组和病例组具有可比性，应避免在非疾病流行的时期或地区招募研究对象，此原则可以避免招募没有患该病风险的研究对象。
1.2.3 对照组的选择应独立于研究因素的暴露状态
避免因研究因素暴露状态而造成对照组样本的选择偏差，从而影响研究结果。例如在流感疫苗效果评价中，研究对象的选择应独立于疫苗接种情况，以避免由此造成的偏倚。
1.3 基本理论假设[]
以疫苗上市后的效果评价研究为例，TND的基本理论假设是，所研究的暴露因素（如疫苗）是某目标病原体所致结局（如感染、发病、重症、或死亡）的影响因素（保护因素或危险因素），其他病原体也可导致目标疾病的类似症状，但所研究的暴露因素对其他病原体（非目标病原体）没有影响。
02
设计与实施要素
尽管TND较传统队列研究和病例对照研究简便易行，但不可随意实施，需充分把握和严格实施每一个研究步骤，以保证研究质量。已有国内学者对TND的实施步骤做详尽展示[]，下面简要介绍TND设计与实施的重要因素。
2.1 研究目的
TND的目的是研究某种暴露因素的保护性或危险性，具体实施需对暴露因素进行明确定义，如暴露因素为疫苗时，需确定疫苗的种类、剂次等。
2.2 研究对象
研究对象应是符合同一症候群的医疗卫生机构就诊人群，需要根据暴露因素所针对的疾病、人群和地区而确定。此外，需注意研究对象中年龄、性别、高危状态（如基础疾病）等重要因素的分布[]，不同特征人群的研究结果可能有很大差异，可调整或控制这些因素或适当分层分析以减少由此带来的混杂偏倚。
2.3 样本量计算
目前尚无针对TND的样本量估计方法，多数研究未详细阐述样本量估计过程[]，可以参照非匹配病例对照研究的样本量计算[]，计算时需考虑一些参数，包括暴露因素的预期有效性〔优势比（OR）〕、研究因素在对照组或人群中的暴露率（P0）、检测结果阳性人数与阴性人数比例，以及Ⅰ类和Ⅱ类错误概率（α，β）。
样本量估计的计算公式为：
其中Z1-α/2和Zβ分别为α与1-β对应的标准正态分布临界值；P1和P0分别为病例组和对照组的暴露率；P=（P1+P0）/2。P1可以根据P0与OR推算，即P1=（OR×P0）/（1-P0+OR×P0）
2.4 暴露因素收集
即收集研究对象研究因素的暴露情况，例如：在疫苗效果评估中需收集是否接种疫苗、疫苗种类、剂型、完成接种时长等信息。一般情况下，可以通过医疗记录或自我报告的方法来获得相关信息。
2.5 实验室检测
实验室病原体检测判断研究对象是否患病的标准，是TND的关键步骤之一。需预先制定标准检测流程，如样本类型、采集部位，以及选用合适且准确的方法，充分考虑检测方法的特异度和灵敏度。例如：在流感疫苗效果的评价中，rRT-PCR或病毒分离培养是目前理想的检测方法。使用快速诊断试验需谨慎，考虑到快速检测法的灵敏度不高，可能会增加研究对象的错误分类，基于快速检测法的TND可能会低估疫苗的保护效果[]。
2.6 统计学分析
根据检测结果和暴露情况分为4个亚组，并绘制四格表[]，见表1。
表1TND四格表
Table 1Fourfold table method for analyzing the test-negative design
通常采用Logistic回归模型来评价暴露因素的有效性，关键效应量为OR：OR=ad/bc。
暴露因素有效性计算公式为：有效性=（1-OR）×100%。
2.7 实施时间与地区
不同时间、不同地区进行的同一暴露因素效果评价结果可能截然不同，因为目标疾病流行情况和暴露因素可能因时间和地区而不同[]。因此，研究设计时需对研究实施的时间与地区严格定义，并注意对研究结果进行合理谨慎解释。若目标疾病为传染性疾病，效果评价应在目标疾病流行期内实施，因为这一时期的数据可以提供暴露因素有效性的最佳信息[]，尤其在疫苗保护效果的上市后研究中。
03
衍生设计类型
3.1 实时检测阴性设计（real-time test-negative design，rtTND）
rtTND是将实时流感监测与检测阴性设计结合的一种衍生方法[]。rtTND与经典TND的主要区别在于实验室检测结果的时间：经典TND中，实验室检测在研究对象招募后进行，即研究对象纳入时其感染状态是未知的；rtTND则利用已有的电子健康记录，使用研究对象登记时可用的实时实验室检测结果来招募研究对象，并据此设置病例-检测阴性对照比率。目前流感病毒检测已在医疗机构中普遍使用，rtTND可为流感疫苗保护效果的年度评价提供新思路，以提高研究效率，降低研究成本。
3.2 整群随机检测阴性设计（cluster-randomized test-negative design，CR-TND）
整群随机对照试验是评估社区干预措施有效性的金标准。CR-TND是结合了整群随机对照试验和TND的一种新型衍生设计类型，是用于群体水平的前瞻性的TND衍生类型，相较于整群随机对照试验具有更高的效率和便捷性[]。将若干群体单位（如社区、医院），随机分为干预组和无干预组，并对干预组实施干预。研究对象为因目标疾病样症状就诊于研究区域内医疗卫生机构的患者，对研究对象进行目标疾病检测并将其分为病例组和对照组，通过比较病例组和对照组所在群组分布情况来评价干预措施效果。在CR-TND中，随机化至关重要，干预组和无干预组的基线数据均衡性可以很大程度上影响干预效果估计的准确性[]。CR-TND设计示意图见图2。
图2CR-TND设计示意图
Figure 2Schematic diagram of the cluster-randomized test-negative design
04
优势及局限性
4.1 优势
4.1.1 快速简便，易于实施
相较于大型随机对照试验，TND在伦理上更为人性化，在逻辑上更为简单，并且能充分利用现有的电子或纸质医疗记录[]；相较于传统病例对照研究，TND的病例组与对照组来自同一源人群，无需额外寻找其他病例对照。因此，无论是回顾性研究还是前瞻性研究，TND较其他研究设计成本更低，也更容易进行。此外，TND的有效性、准确性也得到证实，在实施良好的情况下，TND可以对暴露因素有效性进行可靠的评估[]。
4.1.2 减少疾病的错误分类
TND通过病原体实验室检测来进行目标疾病患病与否的分类，减少了因患者就诊时疾病分类错误而引起的偏倚与混杂。
4.1.3 减少由于就医态度和行为造成的混杂
传统病例对照研究中，对照组从其他疾病患者中选取，就医倾向很可能因为疾病种类的不同而不同，因此由两组人群的就医倾向差异造成的混杂难以判断和估计。在TND中，对照组和病例组来源于因同一症候群就诊的患者，可以认为两组就医倾向相同。此外，人群的就医态度和行为也可能受到研究因素暴露状态的影响。例如在流感疫苗效果评价中，已接种流感疫苗和未接种疫苗者可能具有不同的就医倾向，这可能与两种人群的健康意识有关，疫苗接种与否带来的就医倾向差异也可能导致对疫苗效果的错误估计。TND也能减少由于研究因素暴露状态带来的就医态度和行为混杂[]。
4.2 局限性
4.2.1 未调查病原体的干扰
TND的基本假设之一是暴露因素对其他病原体没有影响。然而，在真实世界以及研究实际实施过程中，这一条假设是否真正得到满足很可能是未知的或难以掌握的，这可能会造成研究结果的偏倚[]。对照组，即检测阴性人群，可分为两类，（1）其他阳性：目标病原体检测阴性但能够引起同一症候群的其他病原体检测阳性；（2）全阴性：目标病原体和其他病原体检测均为阴性。以流感疫苗为例，如果流感疫苗对其他病原体有交叉保护作用，则估算的疫苗效果将会偏低。也有一些研究发现，已接种疫苗者感染其他病原体的风险会更大，将其他阳性患者作为对照组时会高估疫苗的保护效果[]，这可能是因为"暂时性非特异免疫"[]，即感染目标病原体所获得的免疫力也会对某些其他病原体有效，而疫苗的接种减少了这种暂时性非特异免疫，感染其他病原体的风险增大。然而，也有文献报道其他阳性患者对于最后的结果没有影响[]。目前尚无评估或分析其他病原影响的标准方法或建议，或可将这两类患者分开，分别作为对照组进行分析，以评估其他病原体的影响。
4.2.2 结论外推时需谨慎
尽管如前所述，TND可以很大程度地降低因不同暴露状态下就医倾向不同而造成的混杂，但仍然存在许多影响就医行为的潜在因素，如健康意识的强弱、医疗服务的可及性等，而健康意识的强弱可能会影响生活方式的选择，从而影响疫苗接种倾向、病原体暴露风险等[]。因此，尽管设计严谨和实施良好的TND能够对调查人群（例如就医人群）中的暴露因素有效性进行可靠地估计，但其结果可能无法直接推广至全人群。因此，需注意对研究结果给予恰当解释。
4.2.3 样本的选择偏倚风险
TND的来源人群是因同一症候群前往医疗机构就诊的患者，在其中纳入符合标准的患者作为研究对象，如果人数过多，可按照一定方式抽样，如单纯随机抽样、分层抽样等。利用已有的电子病历等信息将因同一症候群就诊的患者作为研究对象，按照既有的实验室检测结果分为病例组和对照组，此类回顾性的实时检测阴性设计具有极大便捷性，目前已广泛应用于疫苗效果评价中。由于研究对象接受了临床医生要求进行检测，在常规临床检查中，检测的应用可能会受到症状严重程度或研究因素暴露状态如疫苗接种、社区干预等影响，可能会导致研究存在选择偏倚的风险。如果临床医生要求对流感症状严重和有症状且未接种疫苗的患者进行流感病毒检测，那么未接种疫苗者的比例可能会增加，从而导致对疫苗保护效果的高估[]。
05
应用
近年来，TND方法因其便捷性与有效性在疫苗上市后的保护效果评价方面被广泛应用。疫苗上市前，安慰剂-随机对照试验是疫苗保护效果评价的"金标准"，是在"理想环境"下对疫苗的保护效力进行评价；而疫苗上市后，出于伦理学方面的考虑，安慰剂-随机对照试验可能会引发诸多问题[]，且受接种人群、疾病流行模式以及接种实施的影响，疫苗在真实世界的保护效果存在一定差异。因此，疫苗上市后的效果评价一直是公共卫生领域面临的难题，TND提供了一种新的方法，可广泛应用于流感病毒疫苗的效果评价[]。一项系统综述结果表明，纳入的348项应用TND评估疫苗效果的研究中有253项研究评价流感疫苗保护效果，其他疫苗包括轮状病毒、肺炎链球菌、霍乱弧菌、脊髓灰质炎病毒等11种病原体[]。目前多款新型冠状病毒疫苗（以下简称新冠疫苗）逐渐上市并投入使用，其在真实世界的保护效果亟待研究。TND也可为相关研究提供便捷有效的研究设计与方法参考。此外，随着TND不断发展，TND也可逐渐用于各种危险因素研究、干预措施效果评估等方面。2022年BLOEMENKAMP等[]利用英国家庭医生常规诊疗过程中的患者电子健康记录的真实世界数据以及实验室检测结果，采用TND设计评价了新冠疫苗在不同临床风险患者中的有效性。TND具有广阔的应用前景，其衍生设计的出现也为TND的应用提供了新思路，例如UTARINI等[]于2021年在尼日利亚应用CR-TND对登革热社区干预措施的效果进行了评估。下面以流感疫苗、新冠疫苗和登革热干预措施的效果评估为例，介绍TND的应用方向。
5.1 流感疫苗
近年来，TND已成为观察性研究中评估流感疫苗有效性的首选方法。在流感有效性评价的TND中，研究对象是因流感样症状（influenza-like illness，ILI）前往医疗卫生机构就诊的人，所有研究对象接受了流感病毒检测，根据检测阳性者和检测阴性者的疫苗覆盖率比值来估计疫苗有效性。该设计可以应用于流感样症状监测数据、实验室数据或医疗系统数据，前提是需要有流感检测记录，并能够收集或确定疫苗接种状态。此外，该设计可用于研究各类特征人群中的流感疫苗效果评价，如一般人群、特定年龄组[]、特定基础疾病患者[]等，以及可用于不同亚型流感疫苗的效果评估[]。
除评价流感疫苗对流感病毒的有效性外，TND还可应用于流感疫苗的其他方面：用于流感疫苗对预防流感危重症及住院方面的效果评价[]；用于国家或地区季节性流感的年度疫苗效果评价，包括英国[]、美国[]、加拿大[]、荷兰[]、澳大利亚[]在内的一些国家已经采用这种方法监测年度流感疫苗保护效果。
5.2 新冠疫苗
随着新型冠状病毒肺炎的持续流行与变异毒株的接连出现，作为疫情防控的重要措施之一，新冠疫苗的接种工作也在全球广泛开展。根据世界卫生组织（WHO）通报，截至2021-12-10，全球共有137款新冠疫苗进入临床试验阶段，有194款候选新冠疫苗进入临床前评估阶段[]，WHO批准紧急授权使用的新冠疫苗共有8款[]。目前包括美国[]、英国[]、加拿大[]、巴西[]等来自多个国家和地区的研究人员应用TND从多个角度对上市后新冠疫苗的有效性进行了评估，。KIM等[]研究者评估了mRNA疫苗在16岁及以上新型冠状病毒肺炎样门诊患者中对新型冠状病毒感染的保护效果；THOMPSON等[]研究者评估了新型冠状病毒疫苗在预防50岁及以上人群因新型冠状病毒感染住院、入住重症监护室或在急诊、门诊进行护理方面的有效性；LOPEZ BERNAL等[研究者评估了BNT162b2疫苗和ChAdOx1nCoV-19疫苗对新型冠状病毒Delta变异株的有效性，并与Alpha毒株进行比较；STOWE等[]研究者则评估了流感病毒感染是否与降低新冠病毒感染的风险有关，以及是否与死亡、住院、重症监护等更严重的新型冠状病毒肺炎结局有关。评估的角度多种多样，为疫情防控和疫苗接种策略制定提供了丰富的参考信息。
5.3 登革热干预措施效果评价
登革热是一种虫媒病毒疾病，主要通过埃及伊蚊传播[]。病媒控制是登革热防控的关键，常使用社区干预策略，如空间喷洒、幼虫控制等。但干预策略的效果评价是一个亟待解决的难题，目前一项关于昆虫学干预试验的荟萃分析强调，缺乏关于病媒控制方法对登革热防控有效性的可靠证据[]。集群随机检测阴性设计为简便且有效地评估登革热社区干预措施效果提供了可能[]，将研究区域内的若干社区随机分为干预组和无干预组，从因登革热样症状（如发热）就诊于研究区域内医疗卫生机构的患者中招募研究对象，对研究对象进行登革热病毒检测并根据结果将其分为病例组和对照组，通过比较病例组和对照组所在社区的分布情况来评价干预措施效果。在印度尼西亚日惹地区进行的一项研究被认为是CR-TND在登革热社区干预措施效果评估中的首次应用[]，该研究将日惹地区中选取的24个社区随机分为干预组和无干预组，干预措施为使埃及伊蚊感染沃尔巴克氏菌；8 144例就诊于当地初级保健诊所的3~45岁急性发热患者被招募为研究对象，并通过rRT-PCR进行登革热病毒检测，评估社区干预措施的保护效果，结果表明干预措施的保护效果为77.1%〔95%CI（65.3%，84.9%）〕，与对4种血清型登革热病毒的保护效果相似。
06
小结与展望
TND作为一种简便且有效的研究方法，值得推广与应用。近十年来，TND已被广泛应用于疫苗上市后的效果评价，疫苗所针对病原体包括呼吸道病原体（流感病毒[]、新型冠状病毒[]、肺炎链球菌等）、胃肠道病原体（轮状病毒]、霍乱弧菌]等）、其他（脊髓灰质炎病毒[]、人乳头瘤病毒[]、肠道病毒71型[]等），尤其在流感疫苗的效果评估方面，已有国家和地区应用TND监测季节性流感的年度疫苗效果。尽管为数尚少，检测阴性设计在国内也逐渐得到认识与应用，已有学者应用TND对我国流行季流感疫苗的保护效果进行了评价[]，应用TND评估EV-71疫苗效果的有效性也得到了验证[]，TND有望在国内更多种类的疫苗评价中发挥作用。此外，在新型冠状病毒肺炎疫情全球大流行的背景下，无症状感染者的早期发现与管理难度大]，Delta]、奥密克戎[]等新变异株接连出现，TND作为一种简便、快速且有效的研究方法，有助于国内外学者紧急快速评估新冠疫苗及其他干预措施的效果。
除疫苗保护效果的评价研究外，新衍生出的rtTND、CR-TND等设计类型也扩大了TND的应用范围，TND被逐步用于危险因素探索及干预措施效果评价等，具有良好的研究应用前景。随着该方法的广泛应用，未来TND还可用于不同国家及地区对某种疫苗保护效果或干预措施效果的常规评估与监测[]，有助于更好地规划与制定公共卫生应对措施。
近年来，TND已被广泛应用于疫苗上市后的效果评价，也可用于危险因素探索及干预措施效果评价等，在国际全科临床医学相关研究中对该方法的运用越来越多。TND作为一种简便、快速且有效的研究方法，具有广阔的应用前景。TND设计可与全科医生临床实践及数据有机结合，用于开展各类防治措施的有效性评价，例如CR-TND可用于评估社区干预措施的有效性。
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