背景：
NOD-、LRR-和pyrin-含结构域3 (NLRP3)是细胞应激信号的胞质固有免疫传感器，由感染和无菌炎症触发。当检测到激活的刺激时，NLRP3从一个不活跃的同寡聚体多聚体转变为一个活跃的多聚体炎症小体，促进适配器分子ASC的螺旋寡聚体组装。ASC低聚物为caspase-1的激活提供了平台，导致IL-1家族和gasdermin D中的蛋白水解切割和促炎细胞因子的激活，这可以诱导细胞的一种裂解形式死亡。最近对NLRP3激活的细胞需求和NLRP3结构的研究揭示了NLRP3的复杂调控和其激活的多个步骤。
简介：
2022年9月20日，来自德国波恩大学附属医院先天免疫研究所的Eicke Latz教授课题组在Cell Mol Immunol（IF: 22.1）杂志上发表题为“How location and cellular signaling combine to activate the NLRP3 inflammasome”的文章[1]。本文综述了控制NLRP3炎性小体组装的生化和细胞过程，特别强调了结构调控和细胞器的作用。作者还强调了这一炎症途径的代谢控制的最新研究，并讨论了有希望的干预临床靶点。
主要结果：
NLRP3分子激活与细胞器功能障碍。
尽管NLRP3在感染和无菌组织损伤中具有重要作用，但控制和激活NLRP3的确切机制仍有待阐明。不同的细胞扰动触发NLRP3激活，包括细胞离子稳态、溶酶体和线粒体功能或代谢的破坏。然而，这些扰动是如何相互关联的，以及它们是如何汇聚到激活NLRP3的共同分子机制上的，仍然是正在进行的研究领域。
钾离子。
钾外流被认为是激活NLRP3炎性小体的一般上游需求。许多NLRP3激活剂，包括钾离子团尼日霉素和格拉霉素，以及渗透质膜到钾的形成孔毒素，使钾外流。同样，细胞外ATP介导的P2X嘌呤受体7 (P2X7)通道的打开和双孔结构域弱向内整流钾通道2 (TWIK2)也会触发钾离子外流。钾的参与也适用于微粒激活剂，包括胆固醇晶体、二氧化硅和焦磷酸钙晶体，它们在NLRP3激活之前诱导钾外流。值得注意的是，NLRP3激活对钾外流的依赖通常是由增加细胞外钾浓度决定的，在所有情况下都抑制NLRP3炎症小体激活。也许最好的证明NLRP3炎性小体对钾外流依赖的证据是观察到缺乏钾的培养基足以在小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中触发NLRP3炎性小体的激活。然而，虽然钾外流足以激活NLRP3，但并不是所有因素激活NLRP3的绝对必要条件。最近的研究表明，NLRP3的激活也可以与钾无关。咪喹莫特及其相关化合物CL097激活NLRP3，但不触发钾离子外排。
氯化物。
与钾的情况类似，氯外排在NLRP3的炎症小体组装中也发挥着重要作用。据报道，氯离子胞内通道蛋白1 (CLIC1)和4 (CLIC4)是通过控制氯离子外流激活NLRP3所必需的。在LPS启动过程中，这些通道从细胞核转移到质膜，它们的消融减弱了ATP介导的NLRP3激活。另一项独立的研究同样发现了CLICs在NLRP3激活中的作用，并确定钾外排促进CLICs依赖性的氯外排，以获得最佳的NLRP3激活。激酶WNK-1也通过控制氯离子通量调节NLRP3的激活。WNK-1间接控制氯离子/阳离子共转运体的活性，限制氯离子的外流和NLRP3的激活。
钙离子。
胞质钙通量也与NLRP3激活有关，因为它被认为发生在对NLRP3刺激的反应中，包括明矾、MSU和尼尼霉素。钙从细胞外空间或钙储存在内质网和高尔基体进入细胞。虽然钙是许多细胞过程所必需的，但钙稳态的破坏会影响一些细胞器，导致内质网和线粒体应激。然而，与早期的研究相比，最近的系统研究表明，钙通量对大多数NLRP3激活剂都没有反应，而且钙通量对NLRP3激活既不是必要的，也不是充分的。相反，钙在许多不同细胞过程中的作用可能是其对NLRP3激活的重要影响的基础。事实上，钙流入线粒体已被提出加剧线粒体应激和增强NLRP3激活。
线粒体。
线粒体功能障碍与NLRP3炎症小体激活有关，通过线粒体DNA (mtDNA)和线粒体ROS (mtROS)释放到细胞质中，以及通过其作为NLRP3炎症小体组装平台的潜在作用。MtDNA被认为是一种有效的免疫刺激分子，作用于多个PRRs，引发促炎反应。mtDNA在细胞凋亡过程中释放到细胞质中，这需要BAD和BAX信号，以及对各种细胞应激触发器的响应，包括NLRP3激活剂，如ATP，从线粒体的己糖激酶(HK)移位和尼日霉素。mtDNA释放的确切机制仍有待完全阐明，但有人认为其发生在对氧化应激的响应中，需要电压依赖的阴离子通道。重要的是，Shimada等人表明mtDNA必须首先被氧化(ox-mtDNA)才能激活NLRP3。这一发现得到了后续研究的支持，该研究表明，与ox-mtDNA相比，未氧化的mtDNA优先激活炎症小体传感器AIM2。
溶酶体的破坏。
在许多病理条件下，溶酶体损伤或破坏是NLRP3炎症小体激活的关键机制，可以由内源性微粒(包括MSU晶体、胆固醇或以去氧鞘胶质脂质为基础的脂质晶体和淀粉样β聚集物)或外源性微粒(包括二氧化硅、石棉和明矾)的吞噬触发。吞噬晶体堆积在溶酶体腔室中，导致溶酶体酸化增加，溶酶体肿胀，溶酶体膜完整性丧失，最终导致NLRP3炎性小体激活。据推测，NLRP3的激活与溶酶体中组织蛋白酶的释放有关，因为广谱组织蛋白酶抑制剂可阻止溶酶体干扰物对NLRP3的激活。然而，从缺乏一种组织蛋白酶B、S、L、C或X的小鼠和缺乏所有五种组织蛋白酶的小鼠制备的BMDMs显示NLRP3炎症小体激活没有变化或只是轻微下降。
内质网（ER）。
内质网与NLRP3有多种关联，包括内质网应激、胆固醇稳态调节和NLRP3定位。化合物诱导内质网应激可引起钾外流和ROS的产生，从而触发NLRP3依赖性IL-1β的释放。有趣的是，未折叠蛋白反应，内质网的另一个关键应激反应途径，并没有发挥作用。另一项研究表明内质网应激也可以以一种依赖NLRP3的方式驱动线粒体功能障碍，导致前馈循环和随后的NLRP3激活。先前的一篇报道表明，NLRP3在未受刺激的THP-1细胞中部分与ER共域。这种定位在NLRP3刺激下发生变化，导致NLRP3与ER和线粒体标记物共定位，主要在核周空间。
高尔基体。
高尔基体是近年来研究NLRP3激活机制的一个热点。除了先前描述的涉及SCAP和SREBP2转位到高尔基体以及它们与NLRP3直接相互作用的联系外，另一个重要的相互作用伙伴被证明是蛋白激酶D (PKD)。NLRP3刺激引起高尔基膜中二酰基甘油(DAG)的富集，导致PKD的招募。NLRP3刺激也会引发线粒体和线粒体相关内质网膜(MAMs)在高尔基体周围的聚集，促进PKD磷酸化相关的NLRP3在S293位点。这一事件导致MAMs释放NLRP3，这是形成细胞质NLRP3炎性小体所必需的。最近的一项研究表明，NLRP3的激活与高尔基体之间有更直接的联系，该研究表明NLRP3重新定位到分散的TGN (dTGN)上。
图1：NLRP3细胞定位
NLRP3的结构-功能关系。
直到最近，关于NLRP3的结构排列的信息一直缺乏，主要是由于使用结构分析来分析NLRP3的技术困难。然而，最近的研究检查了NLRP3与NEK7复合物的结构及其非活性低聚体形式，为其结构和结构如何调节功能提供了新的见解。考虑到使用全长NLRP3的困难，早期的结构研究转而集中在x射线结晶学和NMR中NLRP3的效应子PYD上。这些研究揭示了PYD与其NLR结构同源物(NLRP1/4/7/10/12)的相似性;该结构域在不同的NLRs之间包含6个不同长度和方向的螺旋，NLRP3 PYD和ASC PYD通过同源蛋白区域自我关联。
接下来，通过NLRP3与有丝分裂激酶NEK7复合物的晶体结构提供了新的见解。NEK7是NIMA相关激酶家族的一员，被认为是NLRP3的直接相互作用伙伴，它与NLRP3的结合被证明是小鼠巨噬细胞中NLRP3激活所必需的。值得注意的是，这种NEK7依赖性似乎不能以同样的方式扩展到人类系统。NEK7与NLRP3的相互作用导致NLRP3的寡聚。对NEK7-NLRP3晶体结构的结构分析表明，NEK7与NLRP3的NACHT和LRR结构域相互作用。NEK7和NLRP3的突变破坏了相互作用界面，导致重组小鼠巨噬细胞中NLRP3的激活降低。活化蛋白C激酶1的受体(RACK1)也被证明是NLRP3和NEK7的相互作用伙伴。RACK1的敲低通过降低NLRP3与NEK7形成低聚物的能力，强烈抑制BMDMs中NLRP3的激活。此外，利用生物发光共振能量转移(BRET)来区分NLRP3构象的研究表明，RACK1的消融会减弱NLRP3在奈尼菌素作用下从封闭的静息态向开放构象的转变。
调控NLRP3炎性小体激活的翻译后修饰。
先天免疫系统依赖于调节反应强度和持续时间的多层机制。最动态的机制之一是蛋白质的PTMs，它可以通过将一个化学基团或一个小蛋白质结合到蛋白质中的一个氨基酸上来改变蛋白质的结构、定位和活性。PRR信号受以传感器本身及其下游适配器和效应分子为目标的PTMs的广泛调控。NLRP3的几个PTMs已经被确认，这有助于其活化和炎症小体形成的复杂性。
泛素化和去泛素化。
泛素化是第一个关于NLRP3的PTM报道，由E3泛素连接酶催化泛素通过异肽键连接赖氨酸残基。通过添加K48或K63连接的泛素链，NLRP3的泛素化通过针对NLRP3进行蛋白酶体降解或阻止蛋白质相互作用，负调控炎症小体激活的不同步骤。
在基础条件下，E3泛素连接酶有助于维持NLRP3的低水平。例如，F-box/LRR-repeat蛋白2结合NLRP3在W73位点，并通过K689的泛素化导致其降解。含有三部基序的蛋白31 (TRIM31)也通过K48泛素蛋白酶体途径限制NLRP3的丰度。LPS或IL-1β刺激增加胞质TRIM31水平，表明E3连接酶在降低炎症小体激活的反馈回路中发挥作用。NLRP3泛素化和降解也发生在神经系统中，神经递质多巴胺作为一种内源性抑制剂，其机制依赖于LRR区域march7介导的K48泛素化。刺激后，NLRP3需要获得激活许可。Cullin1 (CUL1)与NLRP3结合，促进K689位点K63泛素化，阻断NLRP3与ASC的相互作用，阻止炎症小体组装。
磷酸化和去磷酸化。
通过在丝氨酸或酪氨酸残基上添加一个磷酸基，NLRP3的PTM被磷酸化。磷酸化在调节NLRP3的寡聚和定位中起着主要作用，并协调NLRP3激活所需的信号网络。
在静息状态下，AKT诱导的S5磷酸化阻止了NLRP3的非预期寡聚，从而通过静电排斥阻碍了NLRP3与PYD的相互作用。通过磷酸酶2A (PP2A)去磷酸化S5许可NLRP3用于下游信号，但需要后续的刺激才能完全组装炎症小体。最近发现TBK1和IKKε共同控制AKT，并最终抑制PP2A，限制NLRP3活性。然而，TBK1和IKKε也作用于S5以外的位点，这表明其作用不仅限于AKT。TGF-β-激活激酶1 (TAK1)可能对避免NLRP3的自发激活也很重要，因为在TLR启动和第二信号缺失的情况下，TAK1的缺乏会诱导巨噬细胞中NLRP3的炎症小体激活。TAK1被认为通过阻止NF-κB和细胞外信号相关激酶RIPK1依赖的异常激活以及随后细胞死亡通路的启动来限制NLRP3的激活。
图2：NLRP3翻译后修饰(PTM)
结论和展望：
NLRP3的空间调控和许可依赖于高度动态的细胞内细胞器网络和相互作用伙伴，促进该蛋白成熟为活性形式。此外，在许多情况下，所描述事件的时间顺序仍然难以捉摸;随着特定途径的相对可有可无，这暗示了一个复杂的网络顺序和单独的途径，导致成熟的可激活NLRP3饱和，以实现炎症小体组装。此外，物种、细胞类型和刺激依赖性的变化创造了另一个有待解开的层面。由于本综述中讨论的大部分工作是在巨噬细胞中进行的，这些复杂机制在其他细胞类型和疾病状态中发生的程度仍有待确定。NLRP3在向功能性炎症小体转变的过程中，在不同的条件下定位于不同的细胞器。然而，最近对高尔基体和核内体参与的认识为进一步研究提供了令人兴奋的途径。这些通路的阐明将突出这些不同刺激汇聚的点，形成NLRP3激活的统一模型。
虽然活化和结构之间的关系还有待进一步探索，但结构研究为治疗和研究目的开发药物和抑制剂提供了基础。最近NLRP3笼子的发现为这项工作创造了一个新的和令人兴奋的途径。虽然NLRP3的膜定位有待进一步探索，但将NLRP3的空间和结构研究相结合无疑将对未来的研究产生重大影响。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41423-022-00922-w
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