导读
黄酮类化合物以有效的抗氧化活性和抗高血脂而闻名。苦荞麦芽（Fagopyrum tataricum，STB）由于含有少量抗营养因子和高生物活性物质，如类黄酮，已成为健康食品。本研究旨在通过转录组学和代谢组学分析揭示 STB 在体内的抗高血脂作用及其潜在机制。我们记录了给予高脂饮食的小鼠在有或没有2.5% 和 5% STB 的情况下10周的生理参数，液相色谱-串联质谱和 RNA 测序分别用于获得血清脂质代谢组学和肝转录组学谱。结果表明，STB可以显着减轻高脂饮食小鼠的体重、肝脏和腹部脂肪的增加，同时改善血清中的脂质含量和胰岛素抵抗。值得注意的是，代谢组学分析确定了主要富集在脂肪消化吸收、胰岛素抵抗等途径中的核心差异代谢物。转录组学结果显示，STB 显着改变了PIK3R1、LRP5、SLC10A2 和 FBXO21 的表达水平。这些基因参与了 PI3K AKT 信号通路、碳水化合物的消化和吸收以及 II 型糖尿病通路。在这项研究中，STB对脂质和葡萄糖的代谢表现出显着的影响，具有抗高血脂作用。STB具有开发和应用降脂保健食品的潜力。
论文ID
原名：Transcriptomic and Metabonomic Profiling Reveals the Antihyperlipidemic Effects of Tartary Buckwheat Sprouts in High-Fat-Diet-Fed Mice
译名：转录组学和代谢组学分析揭示了苦荞芽在高脂饮食喂养的小鼠中的抗高血脂作用
期刊：JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY
IF：5.895
发表时间：2022.10
通讯作者：吴琦
通讯作者单位：四川农业大学
期刊简介
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实验结果
1.STB 摄入量对生理参数和食物和水摄入量的影响
喂食 HFD（高脂饮食）和 NFD（标准饮食）的 C57BL/6 小鼠分别用作高脂血症模型和对照组。喂食10周后，HFD组小鼠的体重增加、肝脏重量和脂肪组织重量均显着高于NFD组（p < 0.05），这些结果表明高脂饮食导致小鼠肥胖（表 1）。与HFD组小鼠相比，HFD2.5（含2.5% STB 的 HFD）组和HFD5（含5% STB 的 HFD）组小鼠体重减轻呈剂量依赖性，而HFD2.5组小鼠体重增加无统计学意义（p>0.05）。四组小鼠的摄食量没有显着变化（p > 0.05），表明不同的饮食并没有破坏能量平衡。此外，与单独喂食 HFD 的小鼠相比，HFD5 和 HFD2.5 组小鼠的肝脏和腹部脂肪组织指数显着下降（p < 0.05），并且腹部脂肪组织指数也以剂量依赖性方式变化。因此，通过摄入 STB，小鼠的体重增加和脂质积累减少，食物供应减少。
表1 STB 对体重、肝重、脂肪指数以及食物和水摄入量的影响
2.STB 对高脂饮食引起的肝脏和腹部脂肪脂质积累的影响
高脂肪饮食显着增加了肝脏指数和腹部脂肪组织的体积（II），并且还导致了浅色脂肪肝（I）（支持信息的图S1）。此外，我们在高脂饮食小鼠中观察到肝脏中积聚的脂滴和增大的腹部脂肪细胞（图 1）。组织学分析表明，补充 STB 通过减少大泡性脂肪变性来降低肝脏脂肪变性的程度。补充剂还恢复了典型的肝小叶和肝细胞结构（图 1D）。同时，补充 STB 也恢复了腹部脂肪细胞的体积（图 1H）。这些结果表明，食用 STB 可以在一定程度上以剂量依赖的方式有效减少脂滴在肝脏和腹部脂肪中的积累。
图1 (A-D) 肝脏和 (E-H) 腹部脂肪组织的 H&E 染色图像。黑色箭头表示脂滴。比例尺 = 50 μm。
3.STB对血清生化指标的影响
STB对血清TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）、HDL-C（高密度脂蛋白胆固醇）、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）、ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、胰岛素、瘦素等生化指标的影响见图2。结果显示，血清TC、TG、LDL-C HFD组小鼠体内的浓度显着高于NFD组，尽管HDL-C显着升高。与 HFD 组相比，STB 显着降低血清 TC、TG 和 LDL-C 水平并增加 HDL-C 水平（p < 0.05）。 HFD 组小鼠的 AST显着增加，在 STB 摄入后保持在平均水平 (p < 0.05)。此外，与 HFD 组相比，STB 消耗并未显着改变 ALT（p > 0.05）。尽管如此，与 NFD 组相比，补充高剂量 STB 显着降低了 ALT。此外，STB 摄入显着降低了高脂饮食诱导的血清胰岛素水平并增加了瘦素水平（p < 0.05）。除 AST 和血清胰岛素外，STB 对血清指标的影响也是剂量依赖性的。这些结果表明，STB有效地调节血脂指标并维持肝功能。
图2 STB 补充剂对不同饮食喂养小鼠 (A-D) 血脂水平、(E 和 F) 肝功能指标、(G) 胰岛素、(H) 瘦素和 (I) 血糖的影响。数据表示为平均值 ± SD (n = 6)。不同的字母表示有统计学意义的差异（p < 0.05）。
我们通过腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）分析STB对高脂饮食小鼠血糖的影响（图2I）。与HFD组相比，HFD2.5和HFD5组小鼠在注射30分钟后血糖显着降低（p < 0.05）。结合胰岛素水平，补充STB可有效改善高脂饮食引起的胰岛素抵抗。
4.STB 摄入可改善脂质代谢组学分析
为了进一步研究脂质生物标志物是否与 STB 的生物活性相关，我们使用脂质组学方法分析了喂食或不喂食 STB 的小鼠的脂质组成差异。 HFD组小鼠的PCs、CEs、LPCs、SMs、PEs、LPEs、CERs、PIs、LPIs、LPSs、PAs、LPAs、LPGs的总含量显着提高。同时，与 NFD 组相比，PGs 降低，表明高脂饮食可能导致小鼠脂质代谢紊乱（图 3A）。 STB补充剂降低了除SMs、PEs和LPSs外的所有脂质种类的含量，在一定程度上恢复了高脂饮食引起的脂质代谢紊乱。为了获得比较解释和研究组间的差异，我们获得了两个多元正交投影到潜在结构判别分析 (OPLS-DA) 模型，其验证参数包括NFD 与 HFD的适应度 (R2X = 0.662 和 R2Y = 0.995) 和可预测性 (Q2 = 0.871) 以及 HFD 与 HFD5 的适应度（R2X = 0.611 和 R2Y = 0.997）和可预测性（Q2 = 0.855）。因此，OPLS-DA 可以被认为是一种预测模型，可以有效地评估不同的脂质组谱。 NFD 与 HFD 和 HFD 与 HFD5 分别显示了 OPLS-DA 得分图的明显分离（图 3 的面板 C 和 D）。
图3 血清样本的脂质组学分析。 (A和B) 血清中不同脂质成分的含量。 PC，磷脂酰胆碱；CE，胆固醇酯；LPC，溶血磷脂酰胆碱；TG，三酰基甘油；DG，甘油二酯；SM，鞘磷脂；PE，磷脂酰乙醇胺；FFA，游离脂肪酸；LPE，溶血磷脂酰乙醇胺；CAR，肉碱；CER，神经酰胺；MG，单酰基甘油；PI，磷脂酰肌醇；LPI，溶血磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；COQ，辅酶Q；LPS，溶血磷脂酰丝氨酸；PG，磷脂酰甘油；PA，磷脂酸；LPA，溶血磷脂酸；LPG，溶血磷脂酰甘油。（C和D）OPLS-DA 得分图和 NFD 与 HFD 的 log2 FC 值。（E 和 F）OPLS-DA 得分图和 HFD 与 HFD5 的 log2 FC 值。 (G) 维恩图分析。具有显着差异的脂质种类通过火山图的FC≥2或≤0.5和VIP≥1的标准来确定。红色（上调）和绿色（下调）点分别代表具有显着差异的脂质种类，而灰色点代表没有显着差异的脂质种类。数据表示为平均值 ± SD (n = 4)。不同的字母表示有统计学意义的差异（p < 0.05）。
在 599 种指示脂质中，HFD5 组中的 436 种显示出与 NFD 组相同的变化趋势，表明补充 STB 大大改善了由高脂饮食引起的脂质代谢障碍。基于火山图分析和维恩图（图 3 的面板 E-G），我们筛选了不同的脂质作为候选生物标志物。根据≥2或≤0.5的FC标准和≥1的预测变量重要性（VIP），我们在NFD与HFD中鉴定出170种显着不同的脂质种类。结合对 HFD 和 HFD5 组之间差异的 13 种代谢脂质分析，我们发现有 7 种脂质与 HFD 小鼠显着不同，但与 NFD 小鼠没有显着差异，7种脂质分别为 PG (18:2/16:0)、Cer (d18:1/22:1)、DG (16:1/18:1/0:0)、PG (16:0/18:1) )、PG (18:1/16:1)、TG (16:1/ 18:2/20:0) 和 TG (12:0/18:1/18:3)。因此，这些结果表明，这7种脂质可能是STB 降脂作用的潜在生物标志物。
我们进行了通路富集分析以阐明具有显着差异的脂质种类的潜在生化和信号转导通路。如图 4 所示，与 NFD 组相比，患有 HFD 的小鼠导致通路紊乱，包括产热、脂肪细胞中脂肪分解的调节、代谢途径、胰岛素抵抗、甘油脂代谢、胆固醇代谢以及脂肪消化和吸收。STB 补充剂改善了上述疾病（图 4B）。
图4 不同脂质种类的脂质代谢途径分析。(A) NFD 与 HFD。(B) HFD 与 HFD5。通过富集因子、p值和在每个途径中富集的脂质代谢物的数量来分析富集程度。气泡大小表示在该途径中富集的显着不同脂质种类的数量。不同层次颜色的点代表p值的范围。富集因子的值越高代表富集程度越高，p值越低代表富集程度非常显着。
5.STB 逆转HFD 诱导的肝转录组改变
为了了解 STB影响高脂饮食小鼠低脂血症的分子机制，我们进行了肝脏转录组分析。首先，我们聚焦于涉及六种脂质代谢途径、葡萄糖代谢和调节途径的基因的丰度。结果显示，在HFD5组中，33个脂肪酸代谢基因、48个过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路基因、38个AMPK信号通路基因、74个胰岛素信号通路基因、83个mTOR信号通路基因和脂肪酸降解中的28个基因的变化趋势与NFD组相同（支持信息的图S2），这表明 STB 在转录水平上促进了高脂饮食诱导的脂质代谢。
我们通过生物信息学和统计方法分析全长 RNA-seq 数据，获得了有关转录组改变的详细信息。我们在不同组之间的三个比较中确定了 DEGs：HFD/NFD、HFD5/NFD 和 HFD5/HFD（图 5 A-C）。 HFD/NFD 比较确定了 482 个上调和 632 个下调的 DEGs，说明高脂肪饮食具有显着的转录组谱。此外，在STB 处理后，我们发现了 46 个上调和 36 个下调的 DEG。 DEG 热图显示三组之间的基因表达模式不同，与HFD组相比，从 HFD5 组获得的转录组谱显示出与 NFD 组更相似的模式（图 5E）。图 5D 中的维恩图表明，与 HFD 组相比，STB 恢复了 HFD5 组中不同基因的表达水平。与 NFD 组相比，高脂饮食增加了 9 个已知基因 Dpy19l3、Pik3r1、Rps27、Saa4、Slc10a2、Trhde、Tuft1、Xlr3a 和 Atxn7l2 以及两个未知基因的表达水平。然而，在上述基因中，所有基因都被 STB减少并且低于 HFD 组中上调的表达水平。此外，与 NFD 组相比，STB 还恢复和减少了 HFD 组中 Atoh8、Fam89a、Fbxo21、Lrp5、Rab11Fip4 和 Tomm40l 等 6 个基因以及 7 个未知基因的表达水平。
图5 肝脏样本的转录组分析。(A) NFD 与 HFD、(B) NFD 与 HFD5 和 (C) HFD 与 HFD5 中显着不同基因的火山图分析。（D）维恩图和（E）热图中显示三个不同组中肝基因的DEGs。使用火山图（n = 3）中 FC≥1 和 p < 0.05 的标准选择显着的 DEGs。显着不同的基因显示为红色（上）或绿色（下）点，灰色点表示没有显着差异。
随后，我们应用 KEGG 分析来识别受 DEG 影响的代谢途径。q 值最低的前 20 条途径显示在图 6 的A-E 中。与 NFD 组相比，HFD 组中上调的 DEGs 主要富集于以下途径：碳代谢、类固醇生物合成、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和年轻人的成熟期糖尿病。下调的DEGs主要存在于以下途径：PPAR信号通路、脂肪酸降解、过氧化物酶体、脂肪酸代谢和氨基酸生物合成。与 HFD 组相比，HFD5 组中上调的 DEGs 在牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径中显着积累，而 HFD5 组中下调的 DEGs 在铂类耐药途径中显着富集。此外，HFD5组STB调控的23个基因与HFD有显着差异，与NFD组无差异，表明这些基因可以作为候选基因（图6E）。这些基因主要与mTOR信号通路、碳水化合物消化吸收以及II型糖尿病通路相关。其中，PIK3R1基因可能发挥核心作用。
为了验证 RNA-seq 分析，我们对选定的基因 PIK3R1、LRP5、SLC10A2 和 FBXO21 进行了定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR)。图 6F 显示 PIK3R1 在 HFD 组肝脏中的转录和蛋白质水平均上调，并在 STB 治疗后逆转。四个基因的表达水平（支持信息的图 6F 和图 S3）与之前指出的 RNA-seq 数据一致。
图6 (A和B) NFD 与 HFD 和 (C和D) HFD 与 HFD5 和 (E) 基因中 DEGs的 KEGG 通路富集分析，HFD5 组与 HFD 有显着差异，而(F) 验证性 qRT-PCR (n = 6) 和肝脏中 PIK3R1 的蛋白质印迹与 NFD 组没有差异。y 轴表示 KEGG 通路名称。点大小表示基因数。点颜色表示 q 值。图中列出了前 20 条 KEGG 通路。
6.腹部脂肪组织中 FAS、PPAR-γ、LPL 和 HMGCS 的相对表达水平
此外，我们使用 qRT-PCR 确定了腹部脂肪组织中基因的相对表达水平，包括 FAS、PPAR-γ、LPL 和 HMGCS（图 7）。与NFD组相比，HFD组FAS、LPL和HMGCS的表达水平显着升高（p < 0.05），而PPAR-γ水平降低。然而，HFD2.5和HFD5组的这四个基因呈现出恢复趋势，标明STB可以减轻腹部脂肪沉积。
图7 FAS、PPAR-γ、LPL 和 HMGCS 在腹部脂肪组织中的表达水平。六次重复，数据表示为平均值±SD。不同字母表示差异有统计学意义（p < 0.05）。
7.组学综合数据
为了阐明基因-代谢物的相互作用，我们在 MetScape 中建立了一个网络，其中包含 106 个基因和 25 个代谢物 ID在高剂量 STB 后被鉴定和改善（图 8）。网络中共有 39 条代谢途径（支持信息的表 S3）。三种类型的代谢模块，包括脂肪酸、胆固醇和磷脂，都参与了脂质代谢。代谢模块、糖代谢和代谢能量与代谢物网络图相关。
图8 来自 MetScape 分析的视觉代谢网络。菱形代表代谢物，圆圈代表基因。
讨论
在过去的十年中，发芽的谷物越来越多地用于人类饮食，因发芽而改变的营养成分通常与健康益处相关。作为传统的小谷物，STB 含有比 TB（苦荞麦）更多的黄酮类化合物，这对调节葡萄糖耐量、炎症因子和抗氧化剂至关重要。一般而言，芦丁、槲皮素和其他黄酮类化合物在脂质代谢指标中发挥调节作用，包括 TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST 和 ALT。研究者已确定 TB 和 TB 提取物都能调节血液中的脂质和糖分，改善肝脂肪变性，减少脂肪细胞大小。本研究系统评估了 STB 在调节低血脂、减轻胰岛素抵抗功能和增强肝脏方面的作用，这与之前的研究一致。鉴于 TB 和 STB 中含有丰富的类黄酮，我们可以推测类黄酮负责调节血脂。然而，另一项研究得出了不同的结论，报告称TB 增加了高脂饮食大鼠的体重，尽管降低了 TG 含量，但对 TC、HDL-C 和 LDL-C 没有显着影响。总之，与TB相比，STB 显示出更好的调脂作用。然而，STB降血脂作用的机制仍不清楚。
代谢组学和转录组学已被证明是揭示代谢途径复杂调节网络变化的有力方法。大麦芽已被证实对肝脏具有保护作用。代谢组学分析确定了习惯性饮酒者食用大麦芽后脂肪酸合成途径的代谢物改变，这与我们的结果相似。除了脂肪酸合成途径外，本研究还确定了属于 PG、CER、 DG 和 TG。这些脂质参与了胰岛素抵抗、甘油脂代谢、胆固醇代谢、脂肪消化吸收等。因此，这些结果表明STB对脂质代谢具有更全面的作用。 TB 蛋白对血浆代谢物的影响已经确定，β-鼠胆酸被认为是受 TB 蛋白调节的关键代谢物。然而，TB 对脂质代谢物的影响需要进一步探索。
同样，很少有关于使用转录组技术验证芽对降血脂功能的影响的报道。研究报告称，在长期食用茉莉酸甲酯 (MeJA) 处理的荞麦芽粉后，饲喂高脂饮食的去卵巢大鼠肝脏 Akt 和 AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 的磷酸化增强。在本文中，我们鉴定了几个与胆固醇和葡萄糖代谢、胆汁酸的肠肝循环和胰岛素抵抗相关的基因，如 PIK3R1、LRP5、SLC10A2 和 FBXO21，其中，PIK3R1 是 PI3K-AKT 中的中心基因信号通路，表明 STB 影响该通路中基因的表达，这与之前的研究一致。此外，STB 证明了癌症治疗的潜力，因为 Atoh8、Tuft1 和 Trhde 等基因与癌症相关，而进一步证实发现，STB 可以预防肥胖和血脂异常，主要归因于调节脂质代谢和糖代谢。
总之，包括血清生化和肝脏组织学在内的结果表明，STB 通过调节脂质合成和改善胰岛素抵抗来改善高脂饮食引起的高脂血症（图 9）。此外，本研究还通过肝脏转录组学和代谢组学的综合应用，阐明了STB的药理机制和潜在治疗作用。在中国、日本和韩国，苦荞芽通常直接作为蔬菜食用。冻干芽粉作为日常辅助保健食品，具有食用方便、生化成分摄入稳定等优点。因此，STB产品的开发和利用是提高肥胖人群健康状况的一种有前途的途径，拥有潜在的市场前景。
图9 STB补充剂预防HFD诱导的小鼠肥胖、高脂血症、肝脂肪变性和腹部脂肪沉积的可能机制。(1)在肝脏中，STB激活LRP5和FBXO21的表达，下调PIK3R1和SLC10A2的表达。(2)血清中脂肪细胞的脂解作用和胰岛素抵抗得到改善。(3)STB在腹部脂肪组织中下调FAS、LPL、HMGCS的表达，上调PPAR-γ的表达。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.2c05382
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