【Mol Plant】 攻克分离根瘤单细胞技术难关，发现共生固氮新机制

生物固氮是农业可持续发展的重要方向之一，其中，豆科植物与根瘤菌共生固氮是全球生物固氮总量贡献最大的模式。根瘤是豆科植物与根瘤菌共生固氮的场所，在这一特殊器官中发生着复杂的物质、能量、信息交流与转化。根瘤可分为定型根瘤（如大豆、百脉根等）和不定型根瘤（如苜蓿、豌豆等），其中不定型根瘤呈现为棒状，具有持续分化的顶端分生组织，空间上从远端到近端可分为不同区域，细胞类型更加复杂；然而，不定型根瘤目前尚无系统性的细胞类型分析，不同细胞类型之间的交互和关联也尚不清楚。

2022年10月28日中国农业大学王涛教授、董江丽教授团队在Molecular Plant上发表了题为“Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula”的研究论文。

该团队攻克了分离根瘤单细胞的技术难关，报道了以截形苜蓿为代表的不定型根瘤单细胞转录组图谱，揭示了成熟的不定型根瘤中不同转录表达模式的细胞类群，以及共生细胞类型和非共生细胞类型的分化轨迹和生物学功能，发现了共生固氮新机制：固氮细胞将氮同化为谷氨酰胺，非固氮细胞将谷氨酰胺转化为天冬酰胺供植物生长发育的新机制。

Figure 1. 截形苜蓿根瘤细胞分群

研究人员首先优化了根瘤原生质体裂解和纯化的实验方案，以截形苜蓿14 dpi的根瘤为样本，共收集获得超过18000个根瘤细胞用于后续单细胞转录组测序和分析。经过数据过滤，共获得9756个根瘤细胞22228个基因的表达数据。在无监督分析条件下，根瘤细胞被分为13个细胞类群，包括2类顶端分生细胞（NA1和NA2），侵染前细胞（PI），侵染细胞（IF），2类固氮细胞（NF1和NF2），根瘤薄壁细胞（NP），2类非侵染细胞（UiC1和UiC2），维管相关细胞（VA），2类未知功能细胞（UN1和UN2），以及混合无定义细胞（MIX）。

通过与根瘤激光捕获显微切割技术（LCM）介导的批量转录组测序（Bulk RNA-seq）进行比较（Limpen et al., 2013; Roux et al., 2014），并筛选各个细胞类群特异性表达的标记基因构建promoter:GUS报告系统进行验证，结果均表明分生细胞NA1和NA2主要位于根瘤顶端分生区，共生类型细胞中侵染前细胞PI和侵染细胞IF主要位于侵染区，NF1主要位于中间区和固氮区，NF2主要位于固氮区；非共生细胞类型中薄壁细胞NP主要位于根瘤中央区外周尤其是顶端区域，非侵染细胞UiC1和UiC2主要镶嵌在根瘤中央区共生细胞类型之间，维管相关细胞VA主要位于外周呈束状环抱根瘤中央区。

Figure 2. 截形苜蓿根瘤不同细胞类群标记基因表达模式

通过拟时序分析发现，共生类型细胞和非共生类型细胞分别从两类顶端分生细胞出发沿不同的轨迹分化。对黄酮类物质合成途径关键基因、氨基酸合成及转运途径关键基因的表达模式进行分析，发现根瘤细胞高度异质，不同细胞类群可能承担着不同的生物学功能。尤其是氨基酸合成途径，氮同化产物谷氨酰胺主要在固氮细胞NF2中合成，而植物利用氮素主要以天冬酰胺形式储存和转运，天冬酰胺则主要在非侵染细胞UiC2中合成；因此，非侵染细胞分担了根瘤氮同化生产线中的重要一环。

该研究通过单细胞转录组测序揭示了不定型根瘤的细胞异质性，测序原始数据已提交至国家基因组科学数据中心NGDC（BioProject: PRJCA012129），并通过网站（www.medicagowang.com/scrna/）将分析结果可视化，为解析豆科植物共生固氮的分子机制提供了重要的数据资源。

中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室王涛教授和董江丽教授为该研究的共同通讯作者，叶沁怡博士、祝富贵博士和在读博士生孙方皓为共同第一作者，博士生王泰程，伍家乐，刘鹏博士，沈晨博士参与了该研究工作。该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金资助。

来源：MP植物科学

转自：“iPlants”微信公众号

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