背景：
肝细胞衰老在人类非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的作用尚不清楚。为了验证这一点，作者对58名有或没有NAFLD/NASH的患者进行了肝脏活检和广泛的特征描述。本研究表明，肝细胞衰老与NAFLD/NASH严重程度密切相关，机器学习分析发现衰老标志物、肝脏和内脏脂肪中的BMP4抑制剂Gremlin 1以及内脏脂肪组织的数量是强有力的预测因子。对由人类星状细胞和肝细胞制成的肝细胞球状体的研究表明，BMP4具有抗衰老、抗脂肪变性、抗炎和抗纤维化的作用，而在人体内脏脂肪中高度表达的Gremlin 1具有促衰老和拮抗BMP4的作用。衰老和抗衰老因子都以YAP/TAZ途径为靶点，使其可能成为衰老及其影响的调控因子。
简介：
2022年8月，来自瑞典哥德堡大学萨尔格伦斯卡学院分子与临床医学系的Ulf Smit教授课题组在Nat Metab（IF: 13.5）杂志上发表题为“BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH”的文章[1]。本研究发现，衰老是人类NAFLD/NASH的重要驱动因素，BMP4和Gremlin 1是新的治疗靶点。
主要结果：
作者进行了广泛的表型分析，包括胰岛素敏感性、口服葡萄糖负荷下的葡萄糖耐量、代谢危险因素和细胞因子，以及58例诊断为NAFLD和NASH的患者的肝活检的转录组学分析。作者首先关注有和没有NAFLD/NASH的个体特征，然后整合关键数据，使用机器学习确定NAFLD/NASH和细胞衰老的最佳预测因子。
肝脏衰老标志物与NAFLD/NASH的严重程度相关。
首先，研究了细胞衰老的关键标志是否与NAFLD或NASH相关。作者检测了肝脏活检中已建立的衰老标记的基因表达，细胞周期蛋白D激酶抑制剂CDKN2A(或p16)和CDKN1A(或p21)，以及溶酶体标记GLB1(或SA-β-Gal)。与健康的瘦人相比，所有的衰老标记物在NAFLD中都显著增加，而在具有相似体重指数(BMI)的NASH个体中进一步上调。
肝脏脂肪量(%)随肝脏疾病的严重程度而增加，并与肝脏衰老标志物密切相关。内脏脂肪面积随着疾病严重程度的增加而增加，并与所有衰老指标呈强正相关。然而，皮下脂肪的数量在NAFLD和NASH之间既无差异，也与衰老标志物无关。由于人类脂肪细胞也会衰老，作者研究了随着疾病严重程度的增加，内脏或皮下脂肪中的衰老标记物是否会增加，但没有观察到差异。
作者检测了NAFLD/NASH和T2D患者的肝脏衰老是否进一步增加，但与非糖尿病患者相比没有发现差异。有趣的是，空腹胰岛素水平与肝脏衰老呈正相关，但这与空腹血糖水平没有关系。更重要的是，胰岛素抵抗程度与肝脏衰老高度一致且显著相关，提示肝脏衰老及相关细胞分泌可能促进全身胰岛素抵抗。与此一致的是，在NAFLD/ NASH中，肝脏信使RNA和循环中不同细胞因子的水平升高，而脂联素(胰岛素敏感性的阳性标记物)降低。值得注意的是，SASP细胞因子IL-1β和IL-6的肝脏mRNA水平也与衰老程度有关。我们分析了衰老标记物与NAFLD/NASH严重程度之间的关系，通过肝脏脂肪变性、肿胀、小叶炎症和纤维化的病理评分来确定。三种衰老指标均与不同评分呈强正相关。
图1：肝脏衰老标志物水平的升高与肝脏脂肪和内脏脂肪组织有关。
NAFLD/ NASH患者肝脏BMP4和GREM1的表达。
与瘦人相比，NAFLD患者肝脏BMP4和GREM1 mRNA水平均较高，NASH患者肝脏BMP4和GREM1 mRNA水平进一步升高，T2D患者肝脏BMP4和GREM1 mRNA水平进一步升高。出乎意料的是，肝脏BMP4与GREM1之间存在很强的正相关。作者还在一个大型的公共队列中验证了NAFLD/NASH患者肝脏BMP4和GREM1增加的发现。
肝脏GREM1与BMP4密切相关，提示GREM1可能抑制BMP4的作用。为了研究这一点，作者测量了BMP信号级联的早期下游标记ID1和ID2的表达。与瘦人相比，作者观察到在NAFLD或NASH中ID1和ID2的表达没有变化，尽管他们的BMP4水平更高。作者在体外肝细胞中证实了这些作用。BMP4添加到永生人肝细胞(IHH)显著增加ID1、ID2和ID3 mRNA水平，而外源性GREM1抑制了这种增加。
接下来，作者研究了NAFLD和NASH中GREM1的增加是否与肝脏衰老的增加有关。事实上，在作者的临床队列中，肝脏GREM1与衰老标志物p21、p16和SA-β-Gal之间存在很强的正相关，表明GREM1和BMP4在调节衰老中起着作用，作者随后也验证了这一点。
图2：肝脏衰老标志物与肝纤维化相关。
阿霉素诱导IHH细胞衰老的作用。
为了研究肝细胞衰老的机制和后果，作者将人IHH细胞与化疗药物阿霉素(DOX)孵育，阿霉素是一种公认的早衰诱导剂。首先，建立了合适的培养条件，用不同浓度的DOX处理细胞2 h，然后用不含DOX的新鲜培养基培养72 h，以确保持久的效果。4µM浓度过高，导致cleaved caspase-3表达增加，细胞死亡增加。然而，细胞变大和变平的形态学记录细胞衰老；ki67阳性细胞数量减少；减少扩散;SA-β-Gal、γH2AX、p16、p21和p53蛋白水平升高;减少了MDM2的磷酸化，增加了MDM2。较低的DOX浓度(即1 μM和2 μM)也有类似的衰老效应，除了裂解caspase-3水平增加外;因此，选择2μM进行进一步的实验。这导致了这些细胞中SA-β-Gal活性的增加，并通过免疫染色证实了p53和p21的增加。衰老细胞有少量的γH2AX染色信号，这是典型的衰老相关DNA损伤。
BMP4减少球状体中的纤维化和炎症标志物。
为了模拟体内微环境，将人肝细胞与造血干细胞(LX-2细胞)一起培养为一个多系球体，代表一个生理体外模型系统。将球体暴露于TGF-β1 48小时后，COL1A1的mRNA和蛋白水平均显著增强(图6a-c)， αSMA蛋白也有所增加。BMP4可显著抑制COL1A1和αSMA蛋白的表达，且表达水平呈浓度依赖性。此外，TGF-β1介导的促纤维化和促炎症标志物CCN2 (CTGF)和CXCL8 (IL-8)的增加被BMP4显著抑制。GREM1对这些基因没有任何直接影响，但它显著阻止BMP4介导的COL1A1、IL-8和CTGF的降低。球状体还暴露于脂肪生成(油酸)和炎症触发物(TGF-β1和肿瘤坏死因子-α，TNF-α)的混合物中，以模拟疾病的不同方面。有趣的是，BMP4以剂量依赖性的方式显著阻止脂质积累和COL1A1蛋白的增加，而GREM1没有发挥任何直接作用。
图3：DOX诱导IHH细胞衰老。
机器学习确定NAFLD/ NASH的最佳预测因子。
NAFLD/NASH。NAFLD/NASH的预测模型显示，最强的特征是肝脏衰老相关的SA-β-Gal、p16和内脏脂肪组织GREM1。Logistic回归显示SA-β-Gal(优势比，23.1;95%置信区间(CI, 1.56 ~ 13323.0)和内脏GREM1(优势比，12.7;95% CI, 2.79 - 175.0)是NAFLD/NASH的重要预测因子。部分依赖分析表明，SA-β-Gal和内脏GREM1水平越高，NAFLD/NASH的可预测性越高。
NASH的纤维化程度。SA-β-Gal、内脏GREM1、肝脏p16和内脏脂肪面积是最强的预测因子，logistic回归显示SA-β-Gal和内脏GREM1与纤维化程度显著相关。部分依赖分析显示，在NAFLD/NASH模型中观察到的相互作用模式相似。
NASH中的脂肪变性、小叶炎症和肿胀程度。通过内脏脂肪面积、皮下脂肪面积、SA-β-Gal和一般肥胖标志物预测病理确定的脂肪变性、小叶炎症和肿胀程度。对于脂肪变性程度，logistic回归显示内脏脂肪面积有统计学意义。回归分析显示，内脏脂肪面积是小叶炎症程度的唯一显著预测因子，而膨胀模型显示，内脏脂肪面积和SA-β-Gal均有统计学意义。
肝脏脂肪。内脏脂肪面积和SA-β-Gal对肝脏脂肪的预测效果最好。部分依赖分析证实了这一点，SA-β-Gal和内脏脂肪是较强的相互作用预测因子。线性回归显示，内脏脂肪、SA-β-Gal和皮下脂肪面积均有统计学意义。
图4：NAFLD/NASH患者的NAFLD/NASH特征和肝脏脂肪的选择预测因子的关联强度。
肝脏衰老相关标记物(SA-β-Gal, p21和p16)。
最强的预测因子是NAFLD/NASH和纤维化程度，其次是其他与衰老相关的肝脏标志物p21和p16。回归还显示，这些预测因素具有统计学意义。SA-β-Gal和NAFLD/NASH是肝脏p21最强的预测因子，其次是GREM1。部分依赖图显示SA-β-Gal以递增的方式增加对p21的预测，肝脏GREM1在预测肝脏p16方面表现出与NAFLD/NASH的强相互作用。
肝脏GREM1和BMP4。GREM1最重要的预测因子是内脏脂肪面积，而膨胀程度在条件随机森林模型中很重要，这证明了较差的模型诊断(条件随机森林均方根误差(r.m.s.e)， 0.56;梯度推进模型R2, 0.88)。但线性回归模型显示，内脏脂肪面积、膨胀程度、分组(即瘦、胖)、肝脏HAMP均有统计学意义。
图4：NAFLD/NASH患者中衰老标志物的选择预测因子与GREM1和BMP4 mRNA水平的关联强度。
结论和展望：
本研究得出的结论是，衰老是人类NAFLD/NASH的重要驱动因素，BMP4和Gremlin 1是新的治疗靶点。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-022-00620-x
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