外泌体的大规模生产及纯化考量

外泌体具有细胞间通讯、维持身体平衡、信号传递和提供免疫稳态等功能。近年来，外泌体在疾病诊断和治疗中的研究迅速增加，另一方面，许多关于外泌体作为药物载体的潜力的研究已经发表。外泌体不仅可应用于肿瘤相关疾病，而且在心血管疾病，自身免疫综合症，神经退行性疾病等方面均有较大的潜力，甚至在药物递送和疫苗的运输中也出现了外泌体的身影。

外泌体在各种生物和病理过程中发挥作用。与脂质体和聚合物纳米颗粒等其他传递系统相比，它具有显著的优势。虽然外泌体被认为是有效的治疗药物，但其临床应用仍然是一个挑战。如何开发大规模生产的方法，是提高其效率和治疗潜力的必要条件。

外泌体的分子组成示意图

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培养基选择

用于产生外泌体的培养基是一个重要的方面。从含血清的培养基中分离出的外泌体具有来自血清的外泌体杂质，而无血清条件可对细胞造成巨大的压力，从而导致外泌体产生的变化。由于血清本身不希望出现的外泌体污染是一个更大的问题，一般来说，研究人员在他们的研究中已经进行了研究，以去除血清。因此，要么使用商业开发的无血清培养基，要么在培养基中使用外泌体耗尽的血清，或者首先在含血清的培养基中培养细胞，并在研究中分离之前去除血清。然而，在这样做的同时，还要注意优化生产条件和表征分离的外泌体的特征。已有研究表明，在培养的肝细胞中使用无异种条件减少了倍增时间，提供了高外泌体产量，并从培养物中去除了高达97%的不需要的蛋白质。

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生产外泌体的设备选择

产生外泌体的细胞在烧瓶中作为静态系统产生，在摇瓶、旋转瓶、滚瓶或生物反应器中作为动态系统产生。静态系统的优点是它操作简单。但是，如果培养需要CO2，O2，pH等特定参数，则需使用具有动态监测系统的生物反应器和大规模生产。从单层细胞中产生外泌体的最大困难是产生它们的培养瓶中的表面积有限。为了克服这一困难，在最大化表面积的中空纤维生物反应器中进行生产，或者在旋转瓶或搅拌罐生物反应器中的微载体上进行生产。

载药外泌体生产过程步骤示意图

在大规模生产中，研究人员集中于中空纤维生物反应器和搅拌槽生物反应器的技术。规模化生产的主要问题是细胞和细胞分泌的外泌体的表型由于剪切应力而发生变化。因此，反应器内部的参数必须根据细胞单元进行控制和优化。

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外泌体分离和纯化

不同液体中存在非囊泡性大分子结构，这使得从组织培养上清液和/或天然体液中纯分离外泌体变得困难。外泌体的分离可以使用不同的方法来完成。所选择的分离方法会影响所获得的外泌体的纯度、数量和理化性质。在选择分离方法时，应考虑诸如快速性、效率、纯度、灵活性、可靠性、易用性和自动化程度等参数。

在外泌体的分离中，采用超离心法作为金标准方法，该方法是基于颗粒密度和大小的变化。然而，这种方法非常耗时，需要昂贵的设备，导致非特异性的纯化和生物活性的降低，而且也难以大规模适应。

超滤（UF）是基于颗粒大小或分子量的变化。这是一个使用膜过滤器和压力来去除大分子尺寸的污染物的过程。它比超离心法更快，不需要昂贵的设备，也可以大规模使用。然而，存在颗粒大小的异质性，需要对系统进行优化，以从污染蛋白中分离出外泌体。

免疫亲和是基于表面生物标记物，分离是通过在磁珠上涂上靶向外泌体表面蛋白的抗体来实现的。尽管其分离纯度较高，但在与抗体结合后还需要额外的分离和纯化步骤，不适合大规模分离。

尺寸排阻色谱（SEC）是一种基于外泌体尺寸差异的色谱柱分离方法。不同尺寸的多个孔和轴有助于补偿色谱柱中的磁珠。根据加载样品中分子的大小差异提供分离。由于重力流压力的限制，此过程将花费更长的时间。

离子交换色谱（IEC）是基于带负电荷的外泌体与带正电荷的色谱柱结合，并通过增加流动相的离子强度与该柱分离的原理。虽然这是一种很容易适用的方法，但它并不提供特定的隔离功能。

基于微流控的技术是一种新技术，利用外泌体的物理和生化特性提供微尺度分离外泌体的外泌体。这项技术将声学、电泳和电磁操作等尖端技术与更传统的尺寸、密度和免疫力等方法相结合。它可以分离高纯度的外泌体，获得更高的效率，但不适合大规模分离。过滤、惯性升力、粘弹性流、声波、介电泳、确定性横向位移（DLD）和基于亲和性的隔离是微流体外泌体隔离方法。

基于膜的分离技术是基于外泌体磷脂双层膜特性的新方法。外泌体外表面的亲水磷酸基团与一些金属氧化物（二氧化钛、二氧化锆等）专门结合。在另一种方法中，根据表面电荷提供隔离。外泌体由于脂质双分子层而带负电荷，可以用一些带正电荷的分子（鱼精蛋白、聚l-赖氨酸包覆的磁珠等）来实现分离。这些技术对大型外泌体更有效，但杂质的发生是因为它们导致其他具有类似膜性质的分子的共分离。

许多通常用于纯化外泌体的方案不能去除具有外泌体的降解颗粒或可溶性物质，这可能导致生物副作用。在体外和体内的研究中，必须遵循可靠的纯化方案和安全性概况，以尽量减少这些不良物质。因此，应该通过优化现有的外泌体分离技术或同时使用多个方法来避免这些问题。

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小结

作为各种疾病的一种可能的治疗选择，外泌体的药物递送潜力已经吸引了科学界的兴趣。尽管外泌体被认为是安全的、生物相容性的和非免疫原性的，但由于其内源性来源，一种未知的生物活性分子混合物的转移带来了一些风险。需要更多的研究来了解外泌体成分的含量和潜在的毒性。同时随着对外泌体研究的不断深入，其应用于临床的潜力也将会逐步被开发，届时如何提高外泌体生产的“质量”与“数量”将会是一个重要的课题。

转自：“博舜科研”微信公众号

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