导读
糖尿病在中医中被称为“消渴症”，因为患者体内重要物质的消耗与食物和水的摄入无关，且无法通过饮水补充水分。野葛(GG)和粉葛(FG)是用于治疗消渴的传统中草药，可降低血糖水平。黄酮类化合物是GG和FG的主要药效成分，也是目前研究最多的成分，而多糖也是GG和FG的活性成分，但研究较少。因此，本研究旨在探讨葛根多糖（GG和FG多糖）对2型糖尿病（T2D）的影响，以及它们在肠道菌群和代谢组学方面的相关作用机制。C57BL/KsJ-db/db 小鼠模型是一种成熟的肥胖诱导T2D模型，用于本研究。代谢组学分析表明，葛根多糖改善了糖尿病小鼠的代谢特征，并显著调节代谢物和代谢途径。GG和FG多糖均通过调节PPAR信号通路调节小鼠胰岛素抵抗从而改善T2D。此外，葛根多糖可调节肠道菌群结构，改善糖尿病相关代谢途径。因此，本研究发现葛根多糖通过涉及肠道菌群和代谢物的多种途径发挥抗糖尿病作用及潜在机制，为进一步研究葛根多糖治疗T2D的作用提供理论依据。
论文ID
原名：Efficacy and Mechanism of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii Polysaccharides in the Treatment of Type 2 Diabetes
译名：野葛和粉葛多糖对2型糖尿病的疗效及机制研究
期刊：Nutrients
IF：6.706
发表时间：2022.09
通讯作者：刘荣华，欧阳辉
通讯作者单位：江西中医药大学
实验结果
1. 药效学分析
1.1 葛根多糖对生理指标的影响
我们在整个实验的5周内评估小鼠的每周体重、食物摄入量、水摄入量和空腹血糖（图1A-D），结果表明，GG和FG多糖可缓解2型糖尿病小鼠的“三多一少”症状（食水摄入、空腹血糖、体重减轻）。葡萄糖耐量（图2）表明GG多糖显著增强了小鼠的葡萄糖代谢，而FG多糖有增加小鼠葡萄糖代谢的趋势。此外，GG和FG多糖改善了小鼠的胰岛素敏感性（图3）。GG多糖和FG多糖的效果之间没有观察到统计学上的显著差异。
图1 (A)葛根多糖对db/db小鼠体重的影响（n = 10；** p < 0.01与模型组相比）。(B)葛根多糖对db/db小鼠饮水量的影响（n = 10；** p < 0.01与模型组相比）。(C)葛根多糖对db/db小鼠摄食量的影响（n = 10；** p < 0.01与模型组相比）。(D)葛根多糖对db/db小鼠空腹血糖的影响（n = 10；* p < 0.05；** p < 0.01与模型组相比）。
图2 葛根多糖对db/db小鼠糖耐量的影响（与模型组相比，n = 10；* p < 0.05；** p < 0.01）。(A)葛根多糖对db/db小鼠血糖值的影响；(B)葛根多糖对db/db小鼠AUC的影响。
图3 葛根多糖对db/db小鼠胰岛素耐受性的影响（与模型组相比，n = 10；* p < 0.05；** p < 0.01）。(A)葛根多糖对db/db小鼠血糖值的影响；(B)葛根多糖对db/db小鼠AUC的影响。
表1 葛根多糖对db/db生化值的影响
与模型组相比，n = 10；* p < 0.05；** p < 0. 01。缩写：INS——胰岛素；HOMA-IR——胰岛素抵抗的稳态模型评估；ADP——脂联素；LEP——瘦素；GLP-1——胰高血糖素样肽1；FFA——游离脂肪酸；IL-6——白细胞介素 6；TNF-α——肿瘤坏死因子。
1.2 生化指标及肝脏组织病理学分析
血清生化指标（表1）显示胰岛素、ADP和GLP-1上调，而LEP、FFA、IL-6和TNF-α降低。此外，我们观察到葛根多糖处理后胰岛素抵抗指数、肝脏指数和脂肪指数有下降趋势。GG多糖组和FG多糖组的上述生化指标无显著差异。此外，二甲双胍、GG多糖、FG多糖干预后，肺泡脂肪滴减少，核固缩和细胞凋亡均有不同程度改善，如图4所示。
图4 db/db小鼠肝组织的H&E染色（放大400倍）
2. 代谢组分析
2.1 与T2D小鼠相关的内源性代谢物和代谢途径
PCA（图5A，B）和OPLS-DA（ESI-：R2Y-0.994，Q2-0.971；ESI+：R2Y-0.938，Q2-0.752）（图5C，D）均表明模型组和正常组之间血清代谢物存在差异。此外，200次置换检验（图6）表明OPLS-DA模型具有较高的解释力和预测能力。我们使用EZinfo软件识别出67种差异代谢物（表2），热图（图7）显示正常组和模型组明显分为两类。涉及不同代谢物的富集代谢途径如图8所示。代谢途径的拓扑分析表明，T2D小鼠与正常小鼠的代谢谱不同主要是由于不饱和脂肪酸生物合成、甘油磷脂、花生四烯酸、α-亚麻酸、甘油、视黄醇和类固醇生物激素的代谢异常所致。
图5 db/db小鼠T2D模型血清的代谢谱分析（（A）NEG，PCA；（B）。POS，PCA；（C）NEG，OPLS-DA；（D）POS，OPLS-DA）。
图6 db/db小鼠T2D模型的PRT分析（（A）NEG，PRT；（B）POS，PRT）。
表2 正常组与模型组小鼠血清中差异代谢物的鉴定
缩略语：“↑”与正常组相比，模型组化合物的相对含量上调；“↓”与正常组相比，模型组化合物相对含量下调。
图7 T2D db/db小鼠差异代谢物的热图分析（对照1-10表示表1中数据。模型代表模型组）。
图8 代谢途径分析概述。1.花生四烯酸代谢；2. α-亚麻酸代谢；3.甘油磷脂代谢；4. 视黄醇代谢；5.类固醇激素的生物合成；6.甘油脂代谢；7. 不饱和脂肪酸的生物合成。
2.2血清GG和FG多糖处理T2D小鼠后的代谢组学分析
PCA（图9A、B和10A、B）和PLS-DA（图9C、D和10C、D）显示GG多糖组和FG多糖组位于正常组和模型组之间。PCA（图9A、B和10A、B）和PLS-DA（图9C、D和10C、D）显示GG多糖组和FG多糖组位于正常组和模型组之间。结果表明，模型组经GG多糖和FG多糖干预后代谢谱及代谢产物变化与正常组更接近，表明它们改善了T2D，这与药效学实验的结果一致。图11A显示了给予GG多糖后具有明显回调的10种代谢物；PE-NMe2 (18:0/20:4 (8Z,11Z,14Z,17Z))，PGP (18:0/PGF1alpha)，PC (20:2(11Z,14Z)/TXB2)，N-油酰苯丙氨酸和PS (18:1(11Z)/6 keto-PGF1alpha)显著增加，以及牛磺胆酸、13-HODE、lysoPC (20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0)、α-亚麻酸和 PA (16:0/18:1(11Z))显著减少。这些代谢物参与不饱和脂肪酸的生物合成、甘油磷脂代谢和α-亚麻酸代谢。图11B显示了在给予FG多糖后具有明显回调的四种代谢物；我们观察到PC (PGF2alpha/2:0)、lysoPE (20:1(11Z)/0:0)和lysoPC (16:1(9Z)/0:0)显著增加，以及尿酸减少。参与这些代谢物的主要途径是甘油磷脂代谢。
图9 用GG多糖处理的T2D db/db小鼠血清中的代谢曲线（（A）NEG，PCA；（B）POS，PCA；（C）NEG，PLS-DA；（D）POS，PLS-DA）。
图10 FG多糖处理的T2D db/db小鼠血清样品中的代谢曲线（（A）NEG，PCA；（B）POS，PCA；（C）NEG，PLS-DA；（D）POS，PLS-DA）。
图11 (A) GG多糖处理后血清中差异代谢物的热图分析。(B) FG多糖处理后血清中差异代谢物的热图分析。
2.3 差异代谢物与生化指标的相关性
我们对差异血清代谢物和生化指标进行Spearman相关分析。结果如图12A、B所示，GG多糖组中牛磺胆酸与各项生化指标的相关系数绝对值最大，而FG多糖组中尿酸与各项生化指标的相关系数绝对值最大，表明GG多糖在T2D处理中显著降低了牛磺胆酸的水平。FG多糖在T2D处理中显著降低了尿酸水平。
图12 葛根多糖干预影响代谢物与生化指标的相关性分析（（A）：GG；（B）：FG；红色代表正相关，蓝色代表负相关，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。
图13 db/db小鼠 (n = 10)在门水平上盲肠微生物群落相对丰度的变化。(A)门水平的群落条形图分析；(B)门水平群落热图分析。
图14 (A)基于加权unifrac距离(n = 10)的db/db小鼠盲肠微生物的PCoA分析；(B)不同组样本在PC1轴上的分布。
3. 肠道微生物群分析
3.1 葛根多糖对肠道菌群物种水平组成的影响
根据Chao 1、Ace、Shannon和Simpson指数分析（表3），葛根多糖干预后盲肠菌群更加丰富多样。各组覆盖指数均在0.99以上，说明测序结果代表了样本中微生物的真实情况。GG多糖组和FG多糖组的上述参数无显著差异。
门的分析（图13A）显示，与正常组相比，模型组中拟杆菌门的相对丰度较高，而厚壁菌门、desulphurobacteria、弯曲杆菌、Deferrobacteriaceae科和放线菌的水平较低。葛根多糖处理逆转了这些被T2D改变菌的相对丰度，在正常小鼠中几乎达到了相同的情况，如图13B所示。我们观察到GG多糖和FG多糖的效果之间没有显著差异。
表3 Alpha 多样性指数分析
图15 db/db小鼠盲肠菌群的LEfSe线性判别分析((A).正常组vs.模型组；(B).模型组vs. FG组；(C).模型组vs. GG组)。
我们对图14A所示的属进行分析，结合基于加权unifrac距离算法的所有样本的PCoA分析，结果显示，图的分离明显，空间聚类明显。图14B中的箱线图代表了不同组样本在PC1轴上的分布，揭示了正常组和模型组之间的差异最大，GG多糖组与模型组的距离大于FG多糖组与模型组的距离。ANOSIM分析表明样品之间存在显著差异，但GG和FG多糖组之间没有出现显著差异。我们采用LEfSe分析，LDA阈值为2，分析正常组和模型组的属水平差异，多组比较策略是一对一的。在属水平上，与正常组相比，我们观察到模型组中45个菌属的丰度存在显著差异，如图15A所示。FG多糖干预5周后18个属的细菌丰度受到显著影响（p<0.05），GG多糖干预5周后14个属的细菌丰度受到显著影响（p<0.05），如图15B，C所示。FG多糖干预后共有20个菌属水平出现回调趋势（图16A），其中g_Helicobacter、g_norank_f_Ruminococcaceae、g_Colidextribacter显著上调，而 g_Eubacterium_siraeum_group和g_Klebsiella 显著下降。共有23个细菌在属水平上有回调趋势（图16B），其中g_Helicobacter、g_Romboutsia和g_UBA1819显著上调，而g_Parasutterella、g_Faecalibaculum和g_Weissella显著下降。GG多糖和FG多糖显著调节除g_Helicobacter之外的不同细菌的含量。
图16 葛根多糖对db/db小鼠盲肠菌群的影响 ((A). FG; (B). GG)
3.2 KEGG富集分析
我们通过PICRUSt功能预测得到代谢途径的三级信息和丰度表。在通路等级1，模型组代谢、有机系统、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和人类疾病通路的表达低于正常组。葛根多糖干预后出现回调趋势（图17）。通路等级2共富集了46个代谢途径亚功能；这些代谢相关途径包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢和其他代谢途径。通路3级预测分析共涉及338条代谢通路，其中153条代谢通路在正常组与模型组之间存在显著差异（p < 0.05）。对这153条具有显著差异的代谢途径分析表明，它们与糖尿病有关，如图18所示。葛根多糖干预后逆转了这些代谢途径的丰度。GG多糖和FG多糖的效果无显著差异。
图17 KEGG通路1级箱形图（与模型组相比，n = 10；* p < 0.05；** p < 0.01）。
4. 差异代谢物与肠道菌群的相关性
我们对葛根多糖相关的细菌类群和差异血清代谢物进行Spearman相关分析，探讨肠道菌群与差异代谢物之间的潜在功能关系。GG多糖干预后，6种细菌与至少3种代谢物有显著关系（p < 0.05）；如图19A所示，在GG多糖处理后，Romboutsia细菌在降低牛磺胆酸水平方面发挥了关键作用。FG多糖干预后，5种细菌与至少一种代谢物有显著相关性（p < 0.05）；如图19B所示，FG多糖处理后，克雷伯氏菌在降低尿酸水平中起关键作用。
图18 KEGG通路3级功能丰度的热图（n = 10）。
图19 葛根多糖干预影响盲肠菌群与代谢物的相关性分析（（A）：GG；（B）：FG；红色代表正相关，蓝色代表负相关，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。
5. 葛根多糖对T2D小鼠PPAR信号通路的影响
与正常组相比，模型组肝蛋白中LKB1、P-AMPK、P-TSC2、PPARγ蛋白表达降低，p-mTOR蛋白表达升高。与正常组相比，模型组肝蛋白中LKB1、P-AMPK、P-TSC2、PPARγ蛋白表达升高，葛根多糖干预后P-mTOR蛋白表达降低。我们在GG和FG多糖的作用之间没有观察到蛋白质表达的显著差异（图20）。
图20 GG多糖和FG多糖对db/db小鼠肝脏蛋白表达的影响((A) LKB1；(B) P-AMPK/AMPK；(C) P-TSC2/TSC2；(D) P-mTOR/mTOR；(E) PPAR γ。*p < 0.05, ** p < 0.01与模型组相比）。
讨论
根据中国药典，GG和FG具有生津止渴的功效。这些植物的类黄酮提取物的降血糖作用已被广泛研究。此外，以往的研究表明GG多糖治疗糖尿病，但FG多糖的治疗作用尚未见报道。本研究将GG多糖和FG多糖在T2D小鼠身上使用5周，从代谢组学和肠道菌群的角度评估其功效并探索其潜在的抗糖尿病机制。
T2D的典型症状是烦渴、多尿、暴饮暴食、体重减轻和疲劳。我们的结果显示模型组较正常组体重增加较慢，水和食物摄入量较高，这与上述描述一致。然而，这些变化在用GG多糖和FG多糖处理后明显逆转。此外，血清中胰岛素、胰岛素抵抗指数、ADP、GLP-1、LEP、FFA、IL-6、TNF-α等生化指标表明GG多糖和FG多糖改善了糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和瘦素抵抗，以及慢性炎症。先前的研究表明，GG的解渴作用与改善胰岛素抵抗有关。我们的药效学研究还证明，GG和FG多糖均能改善胰岛素抵抗，表明两者均具有补液解渴的作用。此外，干预后肝脏指数和脂肪指数呈下降趋势；肝组织切片显示肝细胞内囊泡状脂肪滴减少，细胞固缩和凋亡均有不同程度的改善，说明这两种多糖对肝脏也有一定的保护作用。生化指标显示，GG多糖的生化指标明显优于同剂量的FG多糖，但两种多糖之间差异无统计学意义。
代谢组学技术可用于发现糖尿病患者和健康人之间不同的代谢物，以及药物干预后代谢物的变化，对分析糖尿病发病机制及药物作用机制有很大帮助。例如，一项代谢组学研究发现，50种代谢紊乱的生物标志物在用红参提取物处理后呈现恢复趋势，表明可以通过改善代谢紊乱来改善T2D。之前的一篇文章报道了由代谢组学引起的血清和尿液样本中的差异内源性代谢物，以及使用KEGG富集分析重新评估的人参皂苷的抗糖尿病和抗氧化作用。我们分析了T2D小鼠和正常小鼠血清的代谢谱，共发现了67种差异代谢物，主要是脂质、甘油磷脂、脂肪酸和氨基酸衍生物。通路富集分析表明，差异代谢物参与了不饱和脂肪酸的生物合成和代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、α-亚麻酸代谢、甘油脂代谢、视黄醇代谢和类固醇生物激素的合成。这一结果与先前关于T2D异常代谢途径的研究结果一致。GG和FG多糖干预后，T2D小鼠的代谢曲线几乎恢复到正常组。GG和FG多糖显著调节一些内源性成分，并且均显著调节甘油磷脂代谢途径。PPAR信号通路是调节脂质代谢的重要通路，也是甘油磷脂代谢的上游信号通路，提示这两种多糖可能通过调节PPAR信号通路发挥改善T2D的作用。Spearman相关分析表明，牛磺酸和尿酸是GG和FG多糖改善T2D的关键代谢产物；因此，它们可以用作潜在的生物标志物。
我们对小鼠盲肠内容物的细菌V3-V4区域进行16S rRNA高通量测序，以更好地了解GG和FG多糖的降血糖机制。α多样性和β多样性分析显示，正常组和模型组肠道菌群存在显著差异。但模型组在GG和FG多糖干预后丰富度和多样性均有所提高，肠道菌群组成基本恢复正常组。GG多糖和FG多糖的效果在任何指标上均未观察到显著差异。在门水平上分析各组的物种组成，T2D小鼠肠道菌群中厚壁菌的丰度低于正常组，而拟杆菌的丰度高于正常组，这与另一项研究一致，该研究表明T2D患者肠道菌群中厚壁菌的丰度显著低于正常对照组。GG和FG多糖干预后，拟杆菌门和厚壁菌门的丰度得到改善。模型组与正常组有45个菌属差异。GG多糖对6种有显著回调，FG多糖对5种有显著回调。在血清代谢组学中，受T2D影响的微生物群所涉及的途径与受T2D影响的代谢物所涉及的途径相同。GG多糖处理后显著增加的Romboutsia细菌含量与牛磺胆酸呈负相关，FG多糖处理后克雷伯氏菌含量显著降低与尿酸呈正相关，Romboutsia和克雷伯氏菌是与T2D相关的质量标志物。这些结果表明，T2D通过影响肠道菌群来影响体内的代谢环境，而GG和FG多糖能够通过调节肠道菌群来改善血清中的代谢物。此外，GG和FG多糖干预后，与PPAR信号通路相关的牛磺胆酸和尿酸的丰度被逆转，表明这两种多糖对PPAR信号通路具有调节作用，这与代谢组学结果一致。
药效学、代谢组学和肠道菌群研究结果表明，GG和FG多糖改善T2D的作用与PPAR信号通路的调节有关。GG和FG多糖的作用机制表现为LKB1蛋白、P-AMPK蛋白、P-TSC2蛋白和PPARγ蛋白表达的增加和p-mTOR蛋白表达的减少。这些结果表明，GG和FG多糖可能通过调节PPAR信号通路发挥生津止渴的作用。
我们的结果提示GG多糖和FG多糖改善T2D的疗效之间无显著差异。代谢组学和肠道微生物群分析结果的结合表明，它们使用不同的机制改善体液和解渴：GG多糖通过增加Romboutsia细菌的丰度来降低血清中牛磺胆酸的浓度，从而调节PPAR信号通路，对胰岛素抵抗有改善作用；FG多糖通过减少克雷伯氏菌的丰度来降低血清中的尿酸水平，进而调节PPAR信号通路对胰岛素抵抗发挥治疗作用。两者的调控途径虽然不同，但通过调控相同（PPAR）信号通路，发挥相同的增液解渴作用。
结论
本研究评估了GG和FG多糖对T2D小鼠“三多一少”症状的增津解渴缓解作用。代谢组学和肠道菌群结果表明，GG和FG多糖对血清代谢物和细菌的调节作用不同，但均显著调节甘油磷脂代谢途径。PPAR信号通路也受GG和FG多糖的调控。因此，GG和FG多糖可能通过调节PPAR信号通路在T2D治疗中发挥作用。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36235582/
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