浅谈细胞培养三大步骤

浅谈细胞培养三大步骤

01 

复 苏

细胞复苏的原则：快速融化

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

实验前准备

将水浴锅提前预热至37℃。

细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。

在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

取出冻存管

根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

迅速解冻

迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

平衡离心

用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

制备细胞悬液

吸弃上清液。

向离心管内加入适量完全培养液，吹打制成细胞悬液。

用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。

细胞计数

细胞浓度以5×105/ml为宜。

培养细胞

将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。

记录复苏日期

结果分析

判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。

如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。

××  初学者易犯错误  ××

水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。

水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

02 

传 代

01

传代密度过高

一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）。

解决方案

尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。

细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。

02

传代密度过低

哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

解决方案

细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。

如何确定细胞的正确初始接种密度? 

美国细胞库（ATCC）建议各类不同细胞株接种密度：

https://www.atcc.org/support/faqs/8e032/Seeding%20Density%20for%20Cell%20Lines-25.aspx

03 

冻 存

细胞冻存的基本原理：慢冻

手动降温：将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。

程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充异丙醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。

由此可以看出，程序降温精准度更高，优于手动降温。

大家可以根据自身情况或者实验条件选择不同的冻存方式。

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，可以长期保存。

因为冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。

这时，低温保护剂就发挥出它的作用了。

低温保护剂可保护细胞不受细胞内冰冻影响，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等渗透型低温保护剂。它们的作用机制包括：自由进入细胞，取代水，使冰点下降，充当盐的二次溶剂，提高细胞膜对水的通透性。如下图所示：

但是，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，但它们也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，血清是用来降低细胞毒性的，但血清也不是完美的。

转自：“医学科研小坑”微信公众号

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