本文转自公众号生信人乳腺癌是威胁女性生命安全最高的恶性肿瘤之一， 而且尽管相关的治疗方法日趋先进和完善，但远期生存率仍不理想，且乳腺癌容易向身体的其他区域转移。因此乳腺癌的复发和转移是延长生存期的主要障碍。小编今天就和大家分享一篇今年七月刚刚发表在Nature（IF:69.504）杂志上的高分文章。文章对睡眠与乳腺癌转移的关系进行了研究，并进行了大量实验同时结合生信分析从多个角度证明了睡眠对乳腺癌转移有推动作用，文章的研究角度新颖、逻辑清晰很有启发作用，长话短说，现在小编就带大家一睹为快。
睡眠时乳腺癌的转移扩散加速
一．研究背景已经有研究发现在包括乳腺癌在内的多种癌症类型中，循环肿瘤细胞(CTC)都是转移级联反应的先驱。然而，目前生理情况下调节CTC自发性内渗的因素尚不清楚，一般假设CTC是由浸润性癌组织不断生成，或者由机械信号(如手术)促进生成。此外，在患者和小鼠癌症模型中，对癌症转移进展事件的确切时间，以及决定CTC转移倾向的机制尚不清楚。因此，更好地了解这些过程可能会进一步促进癌症的研究和治疗。
二．文章摘要该研究对乳腺癌患者和小鼠模型中CTC生成的动态模式进行了观察，发现大多数自发的CTC内渗事件发生在睡眠期间。此外，该研究证明了静息期的CTC很容易转移，而活跃期产生的CTC则缺乏转移能力。在机制上，CTC的单细胞RNA测序分析显示，在患者和小鼠模型中，有丝分裂基因仅在静息期显著上调，从而使转移能力更强。研究也发现关键的昼夜节律激素(如褪黑素、睾酮和糖皮质激素)对CTC生成动力学起决定作用，且胰岛素直接促进体内肿瘤细胞增殖，但具有时间依赖性。因此，研究认为自发产生的具有高转移倾向的CTC并非持续发生，而是集中在患者的休息阶段。
1．实验及方法
患者样本及细胞培养：研究纳入了乳腺癌患者休息和活动阶段的外周血样本。研究培养了从1例性激素受体阳性乳腺癌患者制备的BR16细胞的CTC。研究也培养了人乳腺癌细胞MDA-MB-231 LM2，E0771.lmb小鼠乳腺癌细胞和4T1小鼠乳腺癌细胞(ATCC)。研究后续使用携带GFP -荧光素酶或mCherry -荧光素酶的慢病毒转染LM2、BR16和4T1细胞，用携带CD90.1的慢病毒转染lmb细胞。
鼠实验：研究将 LM2 - mCherry -荧光素酶细胞、BR16 - GFP -荧光素酶细胞及4T1 - GFP -荧光素酶细胞注射到8周的NSG雌性小鼠形成原位乳腺癌病灶。此外，研究也将4T1-CD90.1细胞注射于8周的BALB/c雌性小鼠，将E0771.lmb-CD90.1细胞原位注射于8周野生型大鼠或Bmal1基因敲除小鼠。接下来，分别在静息期和活动期抽血进行CTC分析、器官解剖和IVIS生物发光成像。
鼠的治疗：研究在肿瘤发展后，用不同的昼夜调节激素治疗小鼠。在肿瘤注射后10天开始使用褪黑素，此时肿瘤开始呈指数生长，并且外周血中尚未检测到CTC。小鼠每日接受褪黑素或与luzindole 联合治疗，Luzindole在褪黑素处理前进行，褪黑素在静息期(ZT :授时因子时间。ZT0:ZT0定义为早上6点开灯时)开始前给药，接着在ZT0采血并进行CTC检测。研究也在采血(ZT4:静息期)前给予小鼠地塞米松，以避免下丘脑-垂体-肾上腺轴负调控环的激活。研究对肿瘤注射前4天的小鼠注射睾酮埋植剂，并保存至采血日(ZT4)。研究在肿瘤细胞注射后25天开始胰岛素处置，以避免胰岛素对肿瘤生长的影响。小鼠在每天ZT3(静息期)接受胰岛素与葡萄糖并行处置，在ZT4和ZT16(活动期)进行采血和CTC检测，所有给药均采用腹腔注射的方式。
时差综合征实验：研究在注射肿瘤1周后开始倒时差，将动物置于改变光周期的环境中，每2-3天提前8小时。在每个时差休息阶段开始前1.5小时，每天给有时差反应的小鼠服用褪黑激素。静息期开始采血并进行CTC分析。
CTC捕获：研究对于患者样本，采血后1小时内进行CTC捕获。小鼠则采用心脏穿刺取血并立即处理。对于免疫功能低下的模型，样本仅染色CD45，在免疫正常模型中，抗CD45染色与CD90.1染色同时进行，分别识别白细胞和癌细胞。测定捕获的CTC数量包括单个CTC、CTC簇和CTC - WBC簇。
直接转移测定:研究利用自动单细胞收集系统(ALS) CellCelector对单个CTC、CTC簇和CTC - WBC簇进行操作，然后将每个类别的CTC注入受体NSG小鼠的尾静脉。利用IVIS生物发光系统每周无创监测肺内转移的发生和生长速度。
免疫荧光染色和共聚焦分析及流式细胞术:研究对解剖的器官和原发肿瘤进行免疫荧光染色和共聚焦分析，小鼠肿瘤被切碎成碎片后进行流式细胞术。
ScRNA-seq:研究将收集的单个CTC、CTC簇和CTC -WBC簇转入含有裂解液和抑制剂的单个试管中。并按照Smart-seq2方案制备扩增cDNA。使用Nextera XT (Illumina)制备文库，在Illumina NextSeq500测序仪上以75-碱基对单读模式进行测序，每个样本的中位原始测序深度为164万读数。
RNA-seq分析：研究对测序读数用Trim Galore进行了修整，采用FastQC对RNA-seq数据进行质量评估，使用STAR和GENCODE注释并将修剪后的读数与人类基因组参考序列进行比对。研究也对小鼠RNA的残留污染进行了消除。读数计数使用R/Bioconductor中的edgeR包进行标准化，并利用R/Bioconductor中的scater包对数据进行质量控制和可视化处理。标准化后，根据scran的getTopHVGs函数，使用生物成分最大的前500个基因的基因表达进行主成分分析。
差异表达及GSEA: 研究利用 R/Bioconductor中的edgeR包计算差异表达，并利用Benjamini-Hochberg方法对P值进行了校正。使用R/Bioconductor中的clusterProfiler包进行GSEA。
2．主要内容及结果（1） 昼夜节律和CTC内渗在文章第一部分，作者首先试图确定在同一天的活动和休息的进展期乳腺患者的CTC丰度和组成。研究共纳入30例患者(图1a)，其中21例患者在采血时被诊断为早期乳腺癌，9例被诊断为ⅳ期转移性乳腺癌。作者在休息阶段的夜间采集样本中发现了大量CTC，包括单个CTC、CTC簇和CTC -WBC簇(图1a)。接下来为了检验这一发现的普遍性，并确定事件发生的精确时间，作者使用4种不同的乳腺癌小鼠模型移植乳腺癌细胞，并在肿瘤生长后，通过末端血液采样和CTC捕获来检测随时间推移自发产生的CTC。结果发现与患者数据一致，大多数CTC事件出现在小鼠休息期样本中(图1b,c)。作者进一步当以每4小时为间隔对24小时进行时间动力学分析时，观察到CTC释放的振荡模式非常明显(图1b)。当聚焦于小鼠昼夜节律的静止期(ZT4)和活动期(ZT16)两个最具代表性的时间点时，研究观察到在所有测试的模型中，CTC的绝对计数和标准化计数均有显著差异(图1c)。鉴于这些结果，作者得出结论，静息期和活动期观察到的CTC丰度的主要差异归因于内渗率的差异。接下来作者尝试用不同的方法打乱小鼠的生理节律，一方面改变正常的光暗(LD)周期，从而引发时差效应，另一方面，使用褪黑激素对对照组和有时差反应的小鼠进行治疗。结果发现，与对照小鼠相比，时差诱导导致CTC减少。此外，作者也发现，褪黑素诱导会增加CTC、CTC簇和CTC -WBC簇的产生，褪黑素受体拮抗剂luzindole则会干预这些情况，也就是说褪黑素可增加CTC生成，而luzindole可在不影响原发肿瘤大小的情况下减少CTC生成。然后，作者也观察到，在各种光照条件下，CTC数量在静息期均持续增加，这表明光照在CTC内渗中发挥关键作用。最后，考虑到CTC内渗的振荡模式及其与昼夜节律的关系，作者测试这些模式是否在基因敲除小鼠中被消除，研究使用野生型BL/6小鼠(BL/6-E0771.lmb)和Bmal1纯合子敲除小鼠(BL/6- Bmal1−/−-E0771.lmb)(图1d)，发现对照BL/6-E0771的CTC计数在心脏穿刺和肿瘤引流管（ tumour draining vessel，TDV）中都遵循一种典型的振荡模式。在lmb小鼠中，CTC计数的振荡在BL/6-Bmal1−/−E0771中消失。综上所述，这些结果表明在乳腺癌患者和小鼠模型中，单个和集群CTC的释放都是在睡眠期间实现的。
（2） CTCs在睡眠时的转移能力在文章的第二部分作者研究了昼夜节律的不同阶段产生的CTC是否具有不同的转移潜能。作者使用GFP或RFP标记的NSG-LM2异种移植模型，在肿瘤发生后分离出ZT4 (GFP标记)和ZT16 (RFP标记)自发脱落的CTC，最终分离出150个ZT4产生的GFP标记的CTC和150个ZT16产生的RFP标记的CTC，每个CTC都由110个单个CTC、35个CTC簇和5个CTC -WBC簇组成，接着作者在昼夜节律的不同时间点进行无肿瘤受体小鼠的尾静脉注射来测量这些CTC的直接转移能力(图2a)。结果通过体内生物发光成像，作者发现在静息期，尤其是ZT4的转移负荷最高(图2b)。接着为了分析这些转移灶是否来源于ZT4或ZT16 CTC，作者使用抗GFP和抗RFP抗体进行了免疫组化分析，发现大多数转移来自ZT4产生的GFP标记的CTC(图2c)。这些结果表明ZT4 CTC对转移灶的形成具有重要作用，并且在静息期注射ZT4 CTC更容易形成转移灶。接下来，作者试图将这些发现扩展到更多的模型并精确量化静息期与活动期单个CTC、CTC簇和CTC -WBC簇的转移能力，因此作者使用NSG-CDX-BR16和NSG-LM2异种移植模型，在肿瘤发生后，捕获分离自发脱落的CTC。然后，分离出单个CTC、CTC簇的CTC和CTC - WBC簇的CTC，这些CTC分别处于静息期(ZT4)和活动期(ZT16)，接着作者在(ZT12:定义为下午6点熄灯)通过无肿瘤受体小鼠的尾静脉注射这些CTC，来测定其直接转移能力(图2d)。结果发现与ZT16期间获得的CTC相比，ZT4期间获得的CTC表现出更强的转移能力(图2e)。此外，作者也发现，与活动期的CTC相比，静息CTC簇和CTC - WBC簇似乎具有比单个CTC更强的转移形成特征(图2e)。总之，这些结果表明， 静息期不仅CTC内渗率增加，而且它们的转移能力也会增强。
（3）CTC基因表达的时间依赖性接下来，在文章的第三部分作者试图研究CTCs在静止期和活动期转移能力差异的分子特征。作者在小鼠昼夜节律的休息(ZT4)和活动(ZT16)阶段分离出单个CTC, CTC簇和CTC - WBC簇，并分别对它们进行单细胞RNA测序(scRNA-seq;图3 a)。在筛选了高质量样本后，作者从NSG-CDX-BR16模型中获得了138个CTCs，从NSG-LM2模型中获得了108个CTCs，代表了ZT4和ZT16的所有类型CTC。使用主成分分析，作者发现时间点(ZT4 . ZT16)是驱动CTC基因表达变化的关键特征(图3b)。在静息期(ZT4)和活动期(ZT16)分离的样本中，差异基因表达显示ZT4 CTC中有121个上调基因，ZT16 CTC中有156个上调基因，作者也观察到，大多数定义ZT4和ZT16表达特征的基因在所有类型的CTC中都被一致地高度上调，但在CTC簇和CTC -WBC簇中统计学显著性最高。这与单细胞样本中预期的较高变异性和较高脱落率一致。对ZT4和ZT16期间上调基因的基因集富集分析(GSEA)也发现ZT4期间支持有丝分裂和细胞分裂的通路具有高度一致的活性，而ZT16期间则富集到支持核糖体生物发生和基因翻译的通路。此外，在从乳腺癌患者在同一天活动期和休息期分离的人类CTC中，作者发现了与在小鼠模型中观察到的相同的基因表达模式和通路活性(图3f)，且在静止期和活动期的不同时间点也一致(图3g)。考虑到CTC的半衰期短，作者推断原发肿瘤也可以看到细胞增殖的振荡变化。因此，作者使用NSG-CDX-BR16和NSG-LM2模型对增殖标志物Ki67及其CTC进行染色时，发现Ki67在静息期显著上调(图3h)。总之，从患者和小鼠模型中分离出的CTC的分子基因表达分析展示了非常不同的基因表达模式。在睡眠期间，基因表达由细胞分裂和有丝分裂基因主导，而在活动期，则观察到高核糖体生物发生活动。这种振荡增殖时间不仅在CTC中观察到，而且在原发肿瘤中也观察到，这表明这是在疾病进展期间发生在乳腺癌细胞中的普遍现象。
（4） CTC内渗的调控因子
在文章的最后一部分，作者对昼夜节律驱动的CTC生成和增殖的主要调节因子的机制进行了研究。作者分析了来自异种移植物和患者CTC的RNA-seq数据，以确定昼夜节律调节激素、生长因子或分子的受体表达水平，评估了受昼夜节律调节的候选受体表达。结果发现糖皮质激素受体、雄激素受体和胰岛素受体的表达在单个CTC、CTC簇和CTC - WBC簇中高度出现，这表明它们的配体参与了时间点驱动的CTC生成和增殖(图4a)。为了检验这一假设，作者首先用地塞米松或睾酮治疗荷瘤小鼠。结果发现静息期地塞米松单次治疗(ZT2)和睾酮颗粒植入均导致静息期峰值时间采样时单个CTC、CTC簇和CTC - WBC簇显著减少(图4b,c)，且地塞米松或睾酮治疗不影响原发肿瘤的大小，但观察到睾酮治疗小鼠的转移负荷降低。此外，考虑到胰岛素刺激与随后的细胞生长和分裂之间的联系，作者研究了胰岛素是否也会影响乳腺癌细胞的增殖时间和内渗。作者每日在ZT3（ZT3:静息期）用胰岛素和葡萄糖治疗荷瘤小鼠1周，并分别定量静息期和活动期的CTC丰度。结果发现，静息期胰岛素治疗降低了ZT4的CTC内渗，增加了ZT16的CTC内渗(图4d)，而原发肿瘤体积没有显著变化。作者也发现在静息期使用胰岛素治疗也会逆转乳腺癌细胞的增殖周期(图4 e)。总之，这些研究结果表明，乳腺癌细胞的增殖和内渗是由关键的昼夜节律调节激素的每日波动决定的，这些激素的作用影响乳腺癌的转移动力学。
到这里这篇文章的主要内容就介绍完了。文章聚焦于睡眠与乳腺癌转移的关系，结合大量实验与生信分析，证明静息期CTC的内渗及转移能力会增强，并对这一现象的机制进行了分析。文章逻辑清晰，角度新颖，有理有据，为有转移倾向癌症的时间控制性研究和治疗提供了新的理论基础。
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