华中农大李林课题组开发廉价高效的tsCUT&Tag用于体内植物转录因子结合位点的快速鉴定

转录因子在调节基因表达中起关键作用，全面绘制转录因子结合位点图谱将有助于阐明重要作物性状的基因调控网络，但是目前仍缺乏一种低成本和高通量的植物体内转录因子结合位点鉴定方法。虽然染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和DNA亲和纯化技术（DAP-seq）应广泛用于转录因子结合位点的研究，但是ChIP-seq受到稳定转基因材料需求的限制，耗时、成本高且通量低，DAP-seq也局限在无法真实反映体内转录因子与 DNA 的互作。近些年，靶向剪切及转座酶技术（CUT&Tag）已经成功用于动物和植物组蛋白修饰方面的研究，但是应用于植物转录因子方面的研究还较少。

JIPB近日在线发表了华中农大李林课题组题为“A cost-effective tsCUT&Tag method for profiling transcription factor binding landscape”（https://doi.org/10.1111/jipb.13354）的研究论文。该研究开发了一种瞬时转化和简化流程的CUT&Tag方法(tsCUT&Tag)，即将转录因子在植物原生质体中瞬时表达和不依赖于细胞核提取的CUT&Tag方法相结合。此方法大大节约样品准备周期和建库成本，且与传统的ChIP-seq数据相比具有更高的数据质量和信号分辨率以及更低的测序深度。 此外，该研究提出将tsCUT&Tag和ATAC-seq数据与机器学习相结合，可以辅助预测植物不同组织转录因子结合位点，对于解析植物全生育期的转录因子结合图谱上具有巨大的应用潜力。

tsCUT&Tag技术流程概要如下（图1A）：先从特定组织中分离植物原生质体，例如玉米黄化苗和水稻绿叶鞘等。将转录因子克隆到pM999-GFP载体中，在分离的原生质体中瞬时表达。收集大约105个成功转染的活细胞，立即固定在ConA Beads上，并用5% Digitonin预处理细胞以结合一抗和二抗以及pG-Tn5转座酶。最后，基于Tn5转座酶酶切和PCR扩增构建转录因子结合DNA文库。tsCUT&Tag流程因其省略了交联、核提取和 DNA 打断等步骤，使得操作更加简洁。

为了评价tsCUT&Tag数据的有效性，该研究利用两个具有代表性的转录因子，即玉米中的 TB1和水稻中的IPA1，将tsCUT&Tag与传统的ChIP-seq数据进行比较。首先，TB1和IPA1的ChIP-seq和tsCUT&Tag数据表现出高度相关性。在ChIP-seq中鉴定了超过50%的TB1和IPA1的tsCUT&Tag靶向基因（图1E）。从tsCUT&Tag鉴定到的TB1和IPA1基序与ChIP-seq相似（图1F）。与ChIP-seq峰值信号相比，TB1和IPA1的tsCUT&Tag在转录起始位点 (TSS) 附近具有显著更高的信号（图1G）。tsCUT&Tag的FRiP 在TB1和IPA1中都远高于ChIP-seq，表明tsCUT&Tag的信噪比高（图1I）。这些结果表明tsCUT&Tag在鉴定转录因子结合位点上优于ChIP-seq，具有较低的测序深度和较高的信号分辨率。

由于很难从植物不同组织中获得高质量的原生质体并实现高效率转化，为了推断不同组织和发育阶段转录因子的动态调节网络，该研究利用tsCUT&Tag和ATAC-seq数据结合机器学习的方法来预测不同组织中的TFBS。以ZmKNOX6为例，三种机器学习模型（LTSM、TCN 和 SVM）的AUC值在0.91到0.94之间。预测靶基因在两两机器学习模型之间的重叠率高达 73%。与tChIP-seq检测到的绿叶ZmKNOX6靶基因相比，三种机器学习模型预测的靶基因重叠率（68%~69%）显著高于阴性对照和随机开放染色质。结果表明，tsCUT&Tag方法可以与机器学习相结合，可辅助跨不同植物组织间TFBS的鉴定。

本文开发了一种廉价高效鉴定植物转录因子结合位点方法tsCUT&Tag，为体内研究转录因子与DNA的互作提供了一条新的可行性途径。华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室已出站博士后吴雷明（现为安徽农业大学教授）和博士研究生罗姿为该论文的第一作者，华中农大李林教授和江苏省农科院张体付为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费和中国博士后科学基金的资助。

转自：“植物科学最前沿”微信公众号

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