病害是危害农业收成的重要因素,而且会出现程度不同的病害传播,从而扩大损失。因此迅速和准确地识别病原物是发现和采取适当减灾对策的必要条件。而传统的研究中,病原物是根据疾病症状或作物的形态来识别的,许多专性细胞内病原物不能在纯培养中生长,也不能形成生殖结构,这使得它们的检测和鉴定非常困难[1]。
高通量技术的出现,能够同时从数百个样本中识别每个样本中的数千个分类单元,并便于同时研究任何生物体和病毒组,常见的就是借助宏基因组和宏转录组检测和鉴定病原物,以及借助bulk RNA-seq技术探究病害条件下,宿主物种的响应机制。
单细胞技术的出现,将高通量组学在农业病害防治研究领域中的应用,推向了一个新的更为精准的高度。主要体现在以下两个方面:
其一单细胞技术基于poly dT结构捕获mRNA的技术(图1),可以拓展沿用到具有polyA结构的病原物种中,分析病原物种的入侵偏好;
图1 单细胞转录组凝胶珠结构特征
其二单细胞级别分辨率,将基因表达从样本平均水平提升到单个细胞水平,精准定位宿主物种病害响应的主要细胞类型及其分子调控机制。
图2 家蚕核多角体病毒诱导家蚕血细胞枯竭[2]
以上也是单细胞技术在病害防治领域研究中的数据分析挖掘的两大方向,第一种是从病原物种角度出发,第二种是从宿主物种角度出发,目的都是为了解析宿主与病原物种之间的“竞争机制”。今天我们主要来看一看第一种从病原物种角度出发的数据挖掘思路~老规矩,还是用文献案例为大家直观展示!
下面为大家展示的案例是由基迪奥公司客户在去年4月发表的一篇家蚕抗病毒研究文章,基迪奥为客户提供了完整的单细胞转录组测序及数据分析服务,感谢客户的信任,欢迎有测序需求的老师前来咨询~
合作单位:华南农业大学
发表期刊:Frontiers in Immunology
影响因子:7.624
发表时间:2021年4月
#研究背景#
家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrovirus, BmNPV)是杆状病毒的代表,是专门感染家蚕的主要病原体,给蚕业造成严重损失,目前尚无有效防治措施。近年来有关病毒与宿主之间的相互作用有一定研究,但主要是基于分子和蛋白层面,缺乏从宿主细胞免疫层面的解读。基于此,作者借助单细胞转录组技术,绘制了家蚕血细胞图谱,阐明了不同血细胞亚群对BmNPV感染的反应,为探索昆虫对杆状病毒感染的细胞免疫反应提供了有力途径。
#实验设计#
文章以家蚕为研究对象,将刚蜕皮的五龄蚕幼虫随机分为两组,每组各20只,实验组(BmNPV)每只幼虫注射10μL BmNPV-EGFP病毒,对照组(CK)每只幼虫注射等量的PBS,72h后每组各取3ml血淋巴细胞,用于10X Genomics单细胞转录组建库。
#研究思路#
#主要结果#
1. 家蚕血细胞图谱构建
文章一共收集病毒感染组(BmNPV)和对照组(CK) 22286个血细胞进行了单细胞转录组测序,其中BmNPV组包含9114个细胞,CK组包含13172个细胞。细胞聚类分群得到20个亚群(图3A),从cluster0到cluster19细胞数量逐渐减少(图3B)。
图3 A)家蚕血细胞全局图谱;B)各亚群细胞数目统计图
2. 病毒感染细胞亚群鉴定
由于病毒mRNA是多聚腺苷化的,因此scRNA-seq利用poly dT捕获每个细胞内的宿主mRNA的同时也捕获了病毒mRNA,为分析病毒感染的细胞亚群奠定了强有力的数据基础,是单细胞转录组技术在宿主细胞抗病毒研究中的优势。
本文作者通过比对BmNPV病毒基因组,分析了宿主各细胞亚群中病毒基因的载量,结果显示,所有的血细胞都能被BmNPV感染(图4A),并且大多数感染细胞在病毒感染第三天携带高病毒载量(图4B)。
图4 A)病毒基因表达分布tsne图;B)各亚群病毒载量统计图
3. 病毒感染第三天宿主血细胞抗病毒系统处于抑制状态
为了进一步探究宿主细胞对抗病毒的响应机制,作者从组间差异入手,分析了BmNPV感染组和对照组之间细胞频率和基因表达差异。细胞频率分析结果显示,BmNPV感染后,抗病毒应答亚群(cluster 0, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 15, 16, 19)细胞数显著减少(图5A),提示BmNPV通过抑制宿主抗病毒血细胞亚群生成,对抗血细胞抗病毒效应。组间差异基因分析结果显示,与免疫相关的基因在病毒感染组显著下调(图5C),进一步说明了病毒对宿主抗病毒效应的抑制作用。以上分析结果表明,病毒感染第三天宿主血细胞抗病毒系统处于抑制状态。
图5 A)各组分细胞频率统计;B)组间差异基因统计;C)免疫相关基因在组间各亚群细胞中表达分布热图
4. 病毒诱导产生特异性细胞类型
上述细胞频率分析表明,病毒感染前后,组间各亚群细胞频率发生了极为显著的变化,基本上是两极分化,组间几乎没有共有细胞亚群,为了探索病毒感染后的血细胞类型,作者借助文献报道的家蚕四种血细胞类型基于形态学的marker基因对细胞进行鉴定。
结果显示cluster0, 4, 6, 7, 10, 17属于粒细胞(GR),cluster5, 8, 12, 16属于类绛色细胞(OE),cluster14, 15属于浆细胞(PL),cluster19属于血球细胞(SP),而cluster1, 2, 3, 9, 11, 13, 18不属于任何一类,并且这七个亚群都来源于病毒感染组(图6A)。由于缺乏更多的marker基因信息,作者只能借助形态学观察辅助判定细胞类型,形态学结果显示,对照组(CK)样本中主要的细胞类型为GR,而病毒感染组(BmNPV)样本中主要的细胞类型为祖细胞(PR),综合两种鉴定结果作者推断,cluster1, 2, 3, 9, 11, 13, 18可能为祖细胞(图6B)。
图6 A)细胞注释;B)细胞的形态学鉴定
5. 病毒感染影响宿主血细胞分化
文章的最后作者借助monocle2简要的探索了一下宿主血细胞分化轨迹,拟时间轨迹结果显示病毒感染组细胞主要分布在拟时间起点(图7B),符合祖细胞特性,同时,作者解析了不同分化命运下差异表达基因(图7D),为家蚕血细胞分化研究奠定了基础。
图7 A)细胞轨迹图;B)样本细胞轨迹图;C)细胞分化状态;D)分化命运差异基因
【小结】这篇文章是非常典型的从病原物种角度出发探究宿主响应机制的案例。作者借助scRNA-seq的poly(dT)捕获原理,从一次测序数据中,同时获得了病毒和家蚕两份数据,实现了对单细胞病毒载量的分析,以此为出发点筛选病毒主要侵染的细胞类型,进而探究这些细胞类型的基因表达变化及分化命运,最终揭示了病毒通过抑制宿主抗病毒血细胞亚群生成,来对抗血细胞抗病毒效应。
转自:基迪奥生物
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